宋成攀+夏松波+王孝剛+張教海+秦鴻德+張友昌+馮常輝+別墅

摘要：從陸地棉（Gossypium hirsutum L.）HM-40中克隆了查爾酮合成酶GhCHS和查爾酮異構(gòu)酶GhCHI基因。GhCHS基因的開放閱讀框全長(zhǎng)為1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸，查爾酮合成酶含有較多的磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)激酶磷酸化可能與其功能的行使相關(guān)，進(jìn)化分析表明查爾酮合成酶與可可（Theobroma cacao）的CHS蛋白相似性最高；GhCHI基因的開放閱讀框全長(zhǎng)為630 bp，編碼209個(gè)氨基酸，查爾酮異構(gòu)酶含有較多的磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)激酶磷酸化可能與其功能的行使相關(guān)，進(jìn)化分析表明查爾酮異構(gòu)酶與紅麻（Hibiscus cannabinus）的CHI蛋白相似性最高。qRT-PCR分析顯示，在接種大麗輪枝菌VD07菌系后，這兩個(gè)基因表達(dá)量逐漸增加，隨著接菌處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量增加，推測(cè)它們?cè)陉懙孛蘅裹S萎病防衛(wèi)反應(yīng)中可能起重要作用。利用VIGS技術(shù)在嫁接棉中成功地沉默GhCHS基因和GhCHI基因，對(duì)沉默棉株接種大麗輪枝菌VD07，鑒定顯示其病情指數(shù)分別為72.5和67.5，表現(xiàn)為感病；而轉(zhuǎn)化空載體和未沉默的嫁接棉棉株的病情指數(shù)分別為30.0和31.2，表現(xiàn)為耐病，基因沉默后嫁接棉對(duì)黃萎病的抗性喪失。表明GhCHS基因和GhCHI基因在陸地棉抗黃萎病的過程中可能起重要作用。

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum L.）嫁接；查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶；黃萎??；VIGS

中圖分類號(hào)：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）23-4616-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.050

Abstract： Two new genes，GhCHS and GhCHI，were cloned from cotton（Gossypium hirsutum L.） cultivar HM-40，which were selected by iTRAQ of sea-land grafting cotton. The GhCHS open reading frame（ORF） was 1 170 bp and encoded a protein of 389 amino acids. Many phosphorylation sites were found in GhCHS protein， which suggested that the function of GhCHS is related to phosphorylation of these sites. The cloned gene was most closely related to Theobroma cacao CHS protein by phylogenetic analysis. The GhCHI open reading frame was 630 bp and encoded a protein of 209 amino acids. Many Phosphorylation sites were found in GhCHI protein，which suggested that the function of GhCHI is related to phosphorylation of these sites. The cloned gene was most closely related to Hibiscus cannabinus CHI protein by phylogenetic analysis. Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction showed that the two genes were rapidly activated after inoculation with Verticillium dahliae. When time prolonged，genes relative expression always increased. It was assumed that GhCHS and GhCHI might play an important role in the defense reaction against Verticillium wilt. Virus induced gene silencing was used to silence endogenous genes in resistant upland cotton by sea-land grafting cotton targeting a fragment of GhCHS or GhCHI. VD07 was used to inoculate silenced cotton plants to identify disease resistance. The results showed that the disease indices of wild type vector control and sea-land grafting cotton plants were 30.0 and 31.2，respectively. The disease index of silenced GhCHS plants was 72.5，GhCHI plants was 67.5. These results confirmed that the GhCHS gene and GhCHI might relate to Verticillium wilt resistance in cotton.

Key words： cotton（Gossypium hirsutum L.） grafting；GhCHS and GhCHI；Verticillium wilt；VIGSendprint

棉花（Gossypium hirsutum L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花生產(chǎn)關(guān)系到國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活[1]，但是棉花黃萎?。╒erticillium wilt）發(fā)生嚴(yán)重[2]。為了提高棉花的質(zhì)量和產(chǎn)量，棉花黃萎病抗病性的研究受到廣泛重視。研究棉花在大麗輪枝菌侵襲下產(chǎn)生防御過程，有利于闡明棉花在抗黃萎病方面的相關(guān)途徑，尋找到相關(guān)的重要抗病基因，同時(shí)對(duì)大麗輪枝菌脅迫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制進(jìn)行闡明，也將為棉花高抗分子育種提供理論依據(jù)。

查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶都是植物次生代謝過程中黃酮類分子合成的關(guān)鍵酶，合成查爾酮和查爾酮異構(gòu)體，這些物質(zhì)經(jīng)過衍生會(huì)生成多種黃酮類物質(zhì)，在眾多生理生化過程中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)成為抗病抗逆研究和分析的重點(diǎn)[3，4]。查爾酮合成酶與異構(gòu)酶在植物的苯丙氨酸代謝過程以及植物的成長(zhǎng)過程中起重要作用，如植物的抗病能力[5，6]。很多植物的適應(yīng)能力和忍耐力都比較強(qiáng)，能夠在受到多種威脅的情況下積極地作出相應(yīng)的應(yīng)答，使得相應(yīng)的基因得到有效地激發(fā)，產(chǎn)生相應(yīng)的防御反應(yīng)。研究者使用玉米小斑病病菌（Bipolaris maydis）侵染高粱的萌芽，發(fā)現(xiàn)CHS基因表達(dá)量顯著增多，低抗性品種的表達(dá)量比高抗性的品種少得多，并且在持續(xù)時(shí)間上也短一些[7]。研究發(fā)現(xiàn)，查爾酮異構(gòu)酶在調(diào)節(jié)黃酮類化合物的代謝過程中起一定作用[8]。

目前，棉花的抗黃萎病研究主要集中在生理生化特性、抗病基因的克隆、抗病蛋白鑒定和基因組表觀遺傳學(xué)等方面。通過對(duì)受大麗輪枝菌誘導(dǎo)表達(dá)的基因進(jìn)行研究，就是一種研究抗病信號(hào)通路的方式，借此來研究棉花對(duì)黃萎病產(chǎn)生抗性的途徑[9]。本研究克隆了陸地棉基因GhCHS和GhCHI完整的ORF，進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，對(duì)嫁接棉接種大麗輪枝菌后不同時(shí)間的表達(dá)分析，并利用VIGS技術(shù)分別沉默這兩個(gè)基因后，調(diào)查抗病指數(shù)，以期為更深入地研究其功能提供參考[10]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料是陸地棉感病品種HM-40，海島棉高抗品種海7124，由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室鑒定保存，棉苗長(zhǎng)至第二片真葉展開時(shí)（約1元硬幣大?。┘藿?，海島棉為砧木，陸地棉為接穗。待嫁接成活后7 d接種強(qiáng)力致病菌VD07（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國(guó)家棉花生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室朱荷琴提供），每株接菌20 mL，濃度為107個(gè)/mL，接菌方法采用傷根法，分別取0、2、4、6、8、10 d的棉花真葉，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待用。

參照Gao等[11]轉(zhuǎn)化棉花的技術(shù)方法，在嫁接成活后7 d利用VIGS（Virus induced gene silencing）技術(shù)研究基因功能。分別注射接種農(nóng)桿菌pYL-156-pYL-192和pYL-156-GhCHS-pYL-192、pYL-156-GhCHI-pYL-192，在VIGS處理16 d后取嫁接棉真葉，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待用。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化16 d后接種大麗輪枝菌VD07。每株接菌20 mL，濃度為107個(gè)/mL，采用傷根法，接菌25 d后調(diào)查病情指數(shù)。

DP441植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T載體購(gòu)自TAKARA（大連）生物科技有限公司，OMEGA的E.Z.N.A.？誖 Cycle Pure Kit純化試劑盒、EsTaq mix、大腸桿菌感受態(tài)Top 10購(gòu)自武漢歐瑞文生物科技有限公司，Kod plus neo高保真聚合酶購(gòu)自TOYOBO（上海）生物科技有限公司，GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)實(shí)驗(yàn)室自制，煙草脆裂病毒沉默載體pYL-192、pYL-156由清華大學(xué)劉玉樂教授饋贈(zèng)。

1.2 總RNA提取及cDNA制備

用DP441植物RNA快速提取試劑盒提取總RNA，然后用TAKARA PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將棉花真葉總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

1.3 GhCHS和GhCHI基因的克隆

采用Oligo 7設(shè)計(jì)合適的引物。以GhCHS-F（5AGCATAGCAGCTTAGTCCA 3）和GhCHS-R（5 AACTGAATAGGCGTTAAGCTTC 3）為引物，用kod plus neo進(jìn)行基因的擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性，5 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，28個(gè)循環(huán)；后延伸68 ℃，10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。同樣以GhCHI-F（5 CTTGCCTGCCTTAAACCTC 3）和GhCHI-R（5 TCATTTTGGGCTTCACTCA 3）為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖水平凝膠中電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化使用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作。然后采用pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top 10，倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，并且測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。測(cè)序由蘇州金維智科技有限公司完成。

1.4 GhCHS和GhCHI基因的VIGS載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)VIGS引物，以pYL-156-CHS-F（5 CGC GGATCCAGCATAGCAGCTTAGTCCA 3）和pYL-156-CHS-R（5 CCGCTCGAGAACTGAATAGGCG TTAAGCTTC 3）為引物（下劃線部分為保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)），用LA Taq進(jìn)行基因的擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；后延伸72 ℃，10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。同樣以pYL-156-CHI-F（5 CGCGGATCCCTTGCCTGCCTTAAACCTC 3）和pYLendprint

-156-CHI-R（5 CCGCTCGAGTCATTTTGGGCTTCA

CTCA 3）為引物（下劃線部分為保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化使用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作。然后進(jìn)行酶切反應(yīng)，同樣酶切pYL-156質(zhì)粒，solutionⅠ連接4 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top 10，倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，并且測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。測(cè)序由蘇州金維智科技有限公司完成。

提取陽性質(zhì)粒，用農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101電轉(zhuǎn)，涂平板后28 ℃暗培養(yǎng)倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。挑取陽性的農(nóng)桿菌克隆，分別為pYL-156-GhCHS、pYL-156-GhCHI。具體VIGS方法參照Gao[11]。

1.5 克隆基因序列的生物信息學(xué)分析

使用在線軟件Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）和PSORT（http：//www.genscript.com/psort.html）分析這2個(gè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)以及進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。采用SignalP 4.1分析蛋白質(zhì)是否含有信號(hào)肽。采用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜螺旋。然后在NCBI上的protein blast進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)，采用MEGA 5軟件對(duì)其他植物GhCHS和GhCHI蛋白質(zhì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。應(yīng)用NetPhos 2.0程序預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。

1.6 GhCHS和GhCHI基因表達(dá)量分析

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，采用qRT-PCR分析GhCHS和GhCHI基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增目標(biāo)基因引物為qCHS-F（5 TTCAACCATTGGGCATAT CCG 3）和qCHS-R（5 ACTCTGAAAGAACGTGCC TTG 3）、qCHI-F（5 CCATTTTCCAGCAAATTCAGC 3）和qCHI-R（5 TTTCTTGATCATCTCGACCAC 3）；內(nèi)參基因引物為actin-F（5 TCACGGAA GCACCTCTCAAC 3）和actin-R（5 ACAAAGAGA GAACGGCCTGG 3），每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)，使用Bio-Rad CFX96 Manager熒光定量?jī)x進(jìn)行，按照2^-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃，每步增加0.5 ℃，5 s；做溶解曲線以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性延伸5 s。

1.7 VIGS研究GhCHS和GhCHI基因功能的半定量和qRT-PCR分析

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA原液稀釋10倍，半定量分析，用引物V-bCHS-F（5 TTGGATGAGATGAGGAA 3）和V-bCHS-R（5 CA

AAGTAACTTATTATTGCC 3）、V-bCHI-F（5CTGT

GAGGGACCGATTG 3）和V-bCHI-R（5 TGGCAT

TTTCATTTTGG 3），內(nèi)參基因引物為actinB-F（5G

TTATGGTTGGGATGGG 3）和actinB-R（5 CAAGG

TCAAGACGGAGG 3），PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，分別擴(kuò)增20、25、28、31、32、33、34、35、36、37、38個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃，10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖水平凝膠中電泳檢測(cè)。

采用qRT-PCR 分析GhCHS和GhCHI基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增目標(biāo)基因引物為V-qCHS-F（5 T

TTTACCATTCATAGCATAG 3）和V-qCHS-R（5 T

ACGGAAATAGTAGTCAGG 3）、V-qCHI-F（5 ACA

AGGGGAGTGTCTGC 3）和V-qCHI-R（5 TGGCA

TTTTCATTTTGG 3）；內(nèi)參基因引物為actin-F（5 T

CACGGAAGCACCTCTCAAC 3）和actin-R（5 ACA

AAGAGAGAACGGCCTGG 3），qPCR方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉基因GhCHS和GhCHI的克隆

以反轉(zhuǎn)錄得到的陸地棉cDNA為模板，以GhCHS-F（5 AGCATAGCAGCTTAGTCCA 3）和GhCHS-R（5 AACTGAATAGGCGTTAAGCTTC 3）為引物，獲得了1 400 bp左右的陽性條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果見圖2，顯示其ORF全長(zhǎng)為1 170 bp。同樣以GhCHI-F（5 CTTGCCTGCCTTAAACCTC 3）和GhCHI-R（5 TCATTTTGGGCTTCACTCA 3）為引物，獲得了800 bp左右的陽性條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果見圖3，顯示其ORF全長(zhǎng)為630 bp。

2.2 GhCHS蛋白質(zhì)和GhCHI蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

2.2.1 GhCHS蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 使用在線軟件Protparam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，分析GhCHS蛋白質(zhì)，其分子式是C1 900H3 045N507O563S19，其等電點(diǎn)約是6.12，其分子量約是42.608 ku。其氨基酸數(shù)目結(jié)果見表1，含量較多的氨基酸是Leu、Val、Ala、Gly、Glu、Lys，其中呈負(fù)電荷的酸性氨基酸（Glu和Asp）有48個(gè)，呈正電荷的堿性氨基酸（Lys和Arg）有44個(gè)，表明這是個(gè)呈負(fù)電的酸性蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)其不穩(wěn)定指數(shù)為38.76，在體外的哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中表達(dá)時(shí)半衰期約30 h，在酵母中表達(dá)時(shí)半衰期超過20 h，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)半衰期超過10 h，蛋白質(zhì)表現(xiàn)穩(wěn)定。endprint

2.2.2 GhCHI蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 使用在線軟件Protparam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，分析GhCHI蛋白質(zhì)，其分子式是C1 059H1 662N262O322S5，其等電點(diǎn)約是4.86，其分子量約是23.377 ku。其氨基酸數(shù)目結(jié)果見表2，含量較多的氨基酸是Glu、Val、Lys、Ala、Leu、Thr，其中呈負(fù)電荷的酸性氨基酸（Glu和Asp）有34個(gè)，呈正電荷的堿性氨基酸（Lys和Arg）有22個(gè)，表明該蛋白質(zhì)是呈負(fù)電的酸性蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)其不穩(wěn)定指數(shù)為35.39，在體外的哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中表達(dá)時(shí)半衰期約30 h，在酵母中表達(dá)時(shí)半衰期超過20 h，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)半衰期超過10 h，蛋白質(zhì)表現(xiàn)穩(wěn)定。

2.3 GhCHS蛋白和GhCHI蛋白的親疏水性和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.3.1 GhCHS蛋白的親疏水性和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 使用蛋白質(zhì)的親疏水性預(yù)測(cè)在線軟件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/），將GhCHS蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入，分析結(jié)果見圖4，GhCHS蛋白質(zhì)的親水性平均系數(shù)（GRAVY）是-0.096，表明整個(gè)蛋白質(zhì)呈親水性。再將GhCHS蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入到在線分析軟件PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示GhCHS蛋白質(zhì)可能定位于細(xì)胞質(zhì)（得分0.450）、過氧化物酶體（得分0.300）、線粒體基質(zhì)（得分0.100）和溶酶體（得分0.100）；使用SignalP 4.1軟件分析GhCHS蛋白質(zhì)的有無信號(hào)肽序列，結(jié)果顯示GhCHS蛋白質(zhì)無信號(hào)肽序列，那么該蛋白質(zhì)無法進(jìn)行跨膜運(yùn)輸；使用TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)沒有跨膜螺旋區(qū)。根據(jù)以上預(yù)測(cè)，推斷GhCHS蛋白質(zhì)是一種親水性的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)。

2.3.2 GhCHI蛋白質(zhì)的親疏水性和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 運(yùn)用蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測(cè)在線軟件ProtScale，將GhCHI蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入后分析，其預(yù)測(cè)結(jié)果見圖5，GhCHI蛋白質(zhì)的親水性平均系數(shù)（GRAVY）是-0.153，即整個(gè)蛋白質(zhì)呈親水性。運(yùn)用在線分析軟件PSORT（亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)），再將GhCHI蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入，預(yù)測(cè)結(jié)果為GhCHI蛋白質(zhì)定位可能在細(xì)胞質(zhì)（分值0.450）、過氧化物酶體（分值0.206）、溶酶體（分值0.100）與線粒體基質(zhì)（分值0.100）；使用SignalP 4.1軟件分析GhCHI蛋白質(zhì)的信號(hào)肽情況，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)無信號(hào)肽序列，無法跨膜運(yùn)輸；使用TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)沒有跨膜螺旋區(qū)。根據(jù)以上預(yù)測(cè)，推斷GhCHI蛋白質(zhì)是一種親水性的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)。

2.4 GhCHS蛋白質(zhì)和GhCHI蛋白質(zhì)的同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4.1 GhCHS蛋白質(zhì)的同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 采用BlastP進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)陸地棉GhCHS的氨基酸序列與其他物種的該蛋白質(zhì)具有很高的序列相似性。選取12個(gè)代表性物種，如可可（Theobroma cacao，XP_007034442.1）、紅麻（Hibiscus cannabinus，AIC75908.1）、獼猴桃（Actinidia chinensis，AGV53049.1）、山茶（Camellia japonica，BAI66465.1）、甜櫻桃（Prunus avium，AJO67963.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_196897.1）、土豆（Solanum tuberosum，AEN83501.1）、水稻（Oryza sativa Japonica Group，NP_001068009.1）、梨（Pyrus pyrifolia，AFQ92052.1）、鹽膚木（Rhus chinensis，AGH13332.1）、蓮藕（Nelumbo nucifera，ADD74167.1）和蘋果（Malus domestica，BAB92996.1）等，采用MEGA 5.0軟件，同源序列比對(duì)結(jié)果（圖6）顯示，氨基酸序列相似性很高。進(jìn)化樹結(jié)果（圖7）顯示，陸地棉的GhCHS蛋白質(zhì)與可可的XP_007034442.1進(jìn)化關(guān)系較近。

2.4.2 GhCHI蛋白質(zhì)的同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 用BlastP進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)陸地棉GhCHI的氨基酸序列與其他物種的該蛋白質(zhì)具有很高的序列相似性。選取13個(gè)代表性物種，如可可（Theobroma cacao，XP_007011312.1）、紅麻（Hibiscus cannabinus，AIC73814.1）、獼猴桃（Actinidia chinensis，AGV53050.1）、梨（Pyrus pyrifolia，AFQ92051.1）、金花獼猴桃（Actinidia chrysantha，AIY53017.1）、余甘子（Phyllanthus emblica，AHA61355.1）、山竹（Garcinia mangostana，ACM62743.1）、忍冬（Lonicera japonica，AGE10598.1）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum，AHH86093.1）、花生（Arachis hypogaea，AEO17326.1）、浦竹仔（Indosasa hispida，AHC07954.1）、枸杞（Lycium chinense，AIC33515.1）和桑（Morus alba，ALD83622.1）等，采用MEGA 5.0 軟件，同源序列比對(duì)結(jié)果（圖8）顯示，氨基酸序列相似性很高，說明該蛋白質(zhì)在進(jìn)化上比較保守。進(jìn)化樹結(jié)果（圖9）顯示，陸地棉的GhCHI蛋白質(zhì)與紅麻的AIC73814.1 進(jìn)化關(guān)系較近。

2.5 GhCHS蛋白質(zhì)和GhCHI蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.5.1 GhCHS蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)修飾的一種方式，在真核生命活動(dòng)中非常重要，參與并調(diào)控著許多細(xì)胞活動(dòng)。蛋白質(zhì)磷酸化修飾后，會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性、活性以及在細(xì)胞中所處的位置[12]。GhCHS蛋白質(zhì)含有24個(gè)蘇氨酸和22個(gè)絲氨酸，潛在的磷酸化位點(diǎn)較多。運(yùn)用蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)在線軟件NetPhos 2.0，預(yù)測(cè)結(jié)果見圖10，預(yù)測(cè)GhCHS蛋白質(zhì)潛在蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，潛在絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)9個(gè)，潛在酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)2個(gè)。預(yù)測(cè)GhCHS蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)17個(gè)，推測(cè)GhCHS蛋白質(zhì)的功能與激酶磷酸化相關(guān)。endprint

2.5.2 GhCHI蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) GhCHI蛋白質(zhì)含有15個(gè)蘇氨酸和10個(gè)絲氨酸，潛在的磷酸化位點(diǎn)較多。使用在線軟件NetPhos 2.0分析該蛋白質(zhì)，分析結(jié)果見圖11，預(yù)測(cè)潛在的蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)3個(gè)，潛在的絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)3個(gè)，潛在的酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)2個(gè)。預(yù)測(cè)的GhCHI蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)8個(gè)，推測(cè)GhCHI蛋白質(zhì)功能與激酶磷酸化相關(guān)。

2.6 GhCHS和GhCHI基因在大麗輪枝菌VD07脅迫下的相對(duì)表達(dá)量

利用qRT-PCR方法分析GhCHS和GhCHI基因在嫁接棉（7124為砧木，HM-40為接穗）真葉中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖12）顯示，GhCHS和GhCHI基因在接種大麗輪枝菌VDO7菌系后，這2個(gè)基因表達(dá)量逐漸增加，隨著接菌處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量增加，GhCHS基因隨著接菌處理時(shí)間的增加，其表達(dá)量逐漸增加，且第二、四、六、八、十天與未接菌的0 d相比，都存在顯著差異（P<0.05），在第十天時(shí)，該基因的表達(dá)量上調(diào)了約39倍；GhCHI基因隨著接菌處理時(shí)間的增加，其表達(dá)量逐漸增加，且第二、四、六、八、十天與未接菌的0 d相比，都存在顯著差異（P<0.05），在第十天時(shí)，該基因的表達(dá)量提高了約14倍，推測(cè)它們?cè)诩藿用蘅裹S萎病防衛(wèi)反應(yīng)中可能起重要作用。

2.7 利用VIGS技術(shù)研究GhCHS和GhCHI基因的功能

在接種農(nóng)桿菌16 d后分別取接種空載體pYL-156-pYL-192和pYL-156-GhCHS-pYL-192、pYL-156-GhCHI-pYL-192的棉葉樣品提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR；然后進(jìn)行半定量試驗(yàn)（圖13）和qRT-PCR試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)接種帶目的基因載體的比接種帶空載體的基因表達(dá)量分別下降84.74%和87.86%（圖14）。對(duì)未接農(nóng)桿菌處理嫁接棉、轉(zhuǎn)化空載體嫁接棉和基因沉默嫁接棉接大麗輪枝菌后25 d調(diào)查結(jié)果表明，未接農(nóng)桿菌嫁接棉病情指數(shù)為31.2，表現(xiàn)為耐??；轉(zhuǎn)化空載體嫁接棉病情指數(shù)為30.0，表現(xiàn)為耐??；基因沉默嫁接棉病情指數(shù)分別為72.5和67.5，表現(xiàn)為感?。▓D15）。

3 討論

隨著植物基因工程研究的深入，以及新技術(shù)的開發(fā)，生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，植物的許多基因被克隆，并且研究者快速地進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和分析，特別是VIGS技術(shù)的應(yīng)用，許多基因的功能可以快速檢測(cè)，通過轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因進(jìn)行沉默，導(dǎo)致基因不被翻譯成蛋白質(zhì)，達(dá)到RNAi效果，加快了對(duì)基因功能的研究。查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶是植物合成類黃酮的關(guān)鍵酶，植物細(xì)胞中的多種與發(fā)育生長(zhǎng)、抗病抗逆相關(guān)的次生代謝過程都與這一途徑有關(guān)，都參與了植物的防御反應(yīng)。對(duì)于棉花抗黃萎病相關(guān)的研究中，關(guān)于這類酶的研究并不多。

本研究克隆陸地棉的GhCHS和GhCHI基因后，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，GhCHS和GhCHI蛋白質(zhì)均為親水性細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，且GhCHS和GhCHI蛋白質(zhì)均含有較多的磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)激酶磷酸化可能與其功能的行使相關(guān)，另外這兩個(gè)基因均受大麗輪枝菌脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，很可能與植物抗病防御反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了病毒沉默載體，并轉(zhuǎn)化了棉花植株，發(fā)現(xiàn)這兩種基因無論哪一個(gè)喪失功能，均會(huì)導(dǎo)致棉花抗黃萎病抗性的喪失，進(jìn)一步表明了這兩個(gè)基因的生物學(xué)功能，即可能參與了棉花的抗病防御反應(yīng)，為更深入地研究這兩個(gè)基因的功能以及研究棉花抗黃萎病相關(guān)途徑提供理論支持。

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