過聰+張慶華+向發(fā)云+曾祥國(guó)+韓永超+董歡+顧玉成

摘要：以非洲菊（Gerbera jamesonii）嫩葉為材料，研究了不同外植體部位、暗培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基激素等因素對(duì)非洲菊愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的影響。結(jié)果顯示，非洲菊葉片邊緣切口出愈傷速度快于葉柄傷口；帶葉基葉柄出愈傷率最高，誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d出愈傷率為84%以上；葉柄上誘導(dǎo)的愈傷團(tuán)生長(zhǎng)最快，15 d愈傷生長(zhǎng)量在82%以上。愈傷組織誘導(dǎo)期間使用暗培養(yǎng)能降低外植體死亡率，并一定程度上提高愈傷生長(zhǎng)量，但顯著降低了外植體誘導(dǎo)出愈傷率和愈傷質(zhì)量。愈傷增殖培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為MS+TDZ 1.5 mg/L+2，4-D 0.30 mg/L，20 d內(nèi)愈傷增殖量達(dá)到76%以上，有效降低了愈傷組織褐化死亡率，且愈傷組織狀態(tài)良好。

關(guān)鍵詞：非洲菊（Gerbera jamesonii）；愈傷組織；帶葉基葉柄；暗培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S682.1+1；S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）23-4545-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.032

Abstract： The effects of different explant parts，darkness plans and hormones on callus induction and proliferation were studied with unfolded leaf materials in Gerbera jamesonii. The results showed that the callus induction of blade explants was faster than petiole explants. Callus induction rate of winged petiole in 15 days was higher than 84%，while unwinged petiole explants had a highest callus growth rate of over 82%. Using darkness in callus induction had adverse effects on callus induction and quality，though a good for callus volume growth. MS+TDZ 1.5 mg/L+2，4-D 0.30 mg/L was the best medium for callus proliferation，with a callus proliferation rate higher than 76% in 20 days，and good callus tissues with lower death rate from browning as well.

Key words： Gerbera jamesonii； callus tissue； winged petiole； darkness culture

非洲菊（Gerbera jamesonii）為菊科大丁草屬宿根草本花卉，是國(guó)際上廣泛培育的重要觀賞花卉，為世界五大鮮切花之一。非洲菊傳統(tǒng)上以雜交育種和分株繁殖為主，由于傳統(tǒng)育種手段繁殖系數(shù)低、后代性狀不穩(wěn)定等原因，早在20世紀(jì)70年代開始，國(guó)內(nèi)外相繼開展了非洲菊離體快繁研究[1]。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的非洲菊離體快繁以非洲菊莖尖、葉柄直接出芽為主[2-4]。非洲菊不同部位外植體的離體再生能力各異，其中葉片、花托、花梗等外植體更容易先誘導(dǎo)出愈傷組織再分化成芽[5]。近年來(lái)隨著非洲菊市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大，不少研究者針對(duì)非洲菊的愈傷組織再生途徑展開了研究[6-8]。在再生途徑中采用愈傷組織不但能進(jìn)一步提高非洲菊快繁頻率，在非洲菊細(xì)胞工程和基因工程育種中也能提高轉(zhuǎn)化效率，并有效降低嵌合體發(fā)生率[9，10]。葉片及其葉柄部位作為非洲菊營(yíng)養(yǎng)器官，相比于非洲菊的花器官材料，其生長(zhǎng)量大且取材方便。為此，試驗(yàn)在前期的研究基礎(chǔ)上，以非洲菊嫩葉為外植體，對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)條件、外植體取材部位等因素進(jìn)行了研究，并篩選了非洲菊愈傷組織增殖過程中培養(yǎng)基附加激素噻苯?。═DZ）和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的最佳配比方案，以期獲得非洲菊嫩葉誘導(dǎo)愈傷的優(yōu)化方案，為非洲菊離體快繁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試非洲菊（Gerbera jamesonii）為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所大棚內(nèi)苗床中種植的無(wú)病蟲害非洲菊“水粉”母株。取初展開的帶葉柄嫩葉作為試驗(yàn)材料。取樣季節(jié)為夏季，棚內(nèi)平均最高日溫為30 ℃。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 試驗(yàn)材料取回后剪去葉柄基部，并按部位分為葉柄、帶葉基葉柄和葉片，用稀釋了100倍的84消毒液渦旋浸泡15 min，然后于自來(lái)水下沖洗干凈。材料洗凈后在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡30 s，再用0.1%升汞滅菌12 min，無(wú)菌水洗4～5遍后置于無(wú)菌吸水紙上晾干材料上的水分。

1.2.2 培養(yǎng)方案 將滅菌消毒后的葉片外植體在超凈工作臺(tái)內(nèi)以葉脈為中心切割成8 mm×8 mm左右的小塊，葉柄切成8 mm長(zhǎng)大小，并接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，具體配方為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+TDZ 2 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L，分別放置于黑暗環(huán)境或者14 h/10 h光周期中培養(yǎng)，光照度為2 000 lx，培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃。每瓶接種葉片外植體4塊，或接種葉柄（或帶葉基葉柄）2塊。愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基均使用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖和6 g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH為5.8。在愈傷誘導(dǎo)一個(gè)月后開始非洲菊愈傷增殖培養(yǎng)。將愈傷團(tuán)切成大小一致的初始愈傷團(tuán)，每瓶接種6～8個(gè)愈傷團(tuán)。非洲菊愈傷組織增殖培養(yǎng)基的激素配比見表1。其中培養(yǎng)基A與非洲菊愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方相同。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 每天觀察外植體，記錄愈傷組織初次出現(xiàn)時(shí)間。愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)中，分別統(tǒng)計(jì)3種暗培養(yǎng)方案下葉片、帶葉基葉柄和葉柄總個(gè)數(shù)以及培養(yǎng)15 d時(shí)外植體的出愈傷率和愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)。外植體出愈傷率=出愈傷外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%。

統(tǒng)計(jì)愈傷團(tuán)在外植體材料上的體積占比，將誘導(dǎo)出的愈傷組織體積比分為四個(gè)等級(jí)：Ⅰ-已出愈傷組織占誘導(dǎo)材料總體積的1/4及以下；Ⅱ-已出愈傷組織占誘導(dǎo)材料總體積的1/4～1/2；Ⅲ-已出愈傷組織占誘導(dǎo)材料總體積的1/2～3/4；Ⅳ-已出愈傷組織占誘導(dǎo)材料總體積的3/4～1，即外植體幾乎已被愈傷團(tuán)完全包裹。誘導(dǎo)出的愈傷組織總體積比=（0.25×Ⅰ中的外植體數(shù)+0.5×Ⅱ中的外植體數(shù)+0.75×Ⅲ中的外植體數(shù)+1×Ⅳ中的外植體數(shù)）/（1×總外植體個(gè)數(shù)）×100%。

使用千分天平稱量愈傷組織質(zhì)量。其中，初始愈傷團(tuán)的質(zhì)量通過隨機(jī)抽取切好的愈傷團(tuán)29團(tuán)進(jìn)行測(cè)量后計(jì)算平均值得出；在愈傷增殖第20天隨機(jī)抽取不同培養(yǎng)基中愈傷組織測(cè)量質(zhì)量，愈傷團(tuán)增殖率=（愈傷團(tuán)增殖后質(zhì)量-初始愈傷團(tuán)質(zhì)量）/初始愈傷團(tuán)質(zhì)量×100%。愈傷團(tuán)褐化死亡率在愈傷增殖培養(yǎng)20 d時(shí)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)中將葉片、葉柄分開培養(yǎng)，其中葉柄還分為帶葉基葉柄段和不帶葉基葉柄段。試驗(yàn)結(jié)果表明，葉片比葉柄更快速誘導(dǎo)出愈傷組織，葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)第5～6天開始出現(xiàn)皺縮，初次出愈傷時(shí)間為7～9 d，而葉柄切口處出愈傷時(shí)間為10 d以上。帶葉基葉柄最先在葉片切口邊緣誘導(dǎo)出初始愈傷。表2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在愈傷誘導(dǎo)第15天時(shí)，3種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率都在40%以上，其中葉片和帶葉基葉柄均在80%左右；愈傷組織生長(zhǎng)量中最低的為葉片，另外兩種材料的愈傷生長(zhǎng)量均在60%以上。誘導(dǎo)愈傷團(tuán)最多的是帶葉基葉柄，愈傷團(tuán)生長(zhǎng)量最大的是葉柄誘導(dǎo)，其次為帶葉基葉柄?？傮w來(lái)看，帶葉基葉柄是進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體材料。

2.2 暗培養(yǎng)對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

研究愈傷組織培養(yǎng)中的環(huán)境條件，不但有利于愈傷組織的快速誘導(dǎo)，還能在工廠化生產(chǎn)中節(jié)省生產(chǎn)成本。試驗(yàn)中對(duì)非洲菊葉片、葉柄、帶葉基葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)過程進(jìn)行了暗培養(yǎng)條件摸索。分別使用全光照、暗培養(yǎng)7 d和全暗培養(yǎng)培養(yǎng)外植體材料。對(duì)葉片外植體死亡數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，無(wú)暗培養(yǎng)條件下由于褐化死亡的葉片外植體占比較大。

觀察統(tǒng)計(jì)不同暗培養(yǎng)條件對(duì)外植體和愈傷誘導(dǎo)的影響，在培養(yǎng)第10天時(shí)有77%的外植體均已出愈傷組織，以葉片出愈傷為主。愈傷組織初次出現(xiàn)的時(shí)間受暗培養(yǎng)條件影響不大，而主要取決于外植體取材部位。于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d時(shí)統(tǒng)計(jì)出愈傷外植體數(shù)，計(jì)算出愈傷率和愈傷生長(zhǎng)量（表3）。從表3可以看出，各外植體在無(wú)暗培養(yǎng)條件下出愈傷率最高，外植體的愈傷誘導(dǎo)能力隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，長(zhǎng)時(shí)間的全暗培養(yǎng)導(dǎo)致愈傷誘導(dǎo)率減少近50個(gè)百分點(diǎn)。此外，盡管暗培養(yǎng)條件能在一定程度上提升愈傷組織生長(zhǎng)量，但從葉片外植體的培養(yǎng)結(jié)果看，暗培養(yǎng)下的葉片容易黃化，其產(chǎn)生的愈傷組織顏色以淡黃色、白色居多。

2.3 篩選愈傷增殖培養(yǎng)基

外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)月后基本全部誘導(dǎo)出愈傷組織。將狀態(tài)良好、無(wú)污染的愈傷組織和帶外植體殘留組織的愈傷組織切成大小均一的小團(tuán)，轉(zhuǎn)入愈傷增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。愈傷組織增殖的快慢與多種因素有關(guān)，試驗(yàn)選用了3種不同濃度配比的TDZ和2，4-D進(jìn)行愈傷組織增殖研究。對(duì)愈傷組織接種后的褐化率以及增殖速率進(jìn)行了比較分析。

初始接種的愈傷組織體積大小基本一致，稱量后平均質(zhì)量為（0.117 5±0.004 6） g。在愈傷組織增殖第20天時(shí)記錄愈傷團(tuán)增殖質(zhì)量和褐化死亡率，結(jié)果見表4。從表4可以看出，使用愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行愈傷組織的增殖時(shí)，其愈傷增長(zhǎng)緩慢，且更容易褐化死亡。而另外兩種培養(yǎng)基對(duì)愈傷的增殖影響差異不大，愈傷組織20 d能增重76%以上，且褐化率相對(duì)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基降低了約3個(gè)百分點(diǎn)。

從愈傷組織狀態(tài)來(lái)看，培養(yǎng)基B中的愈傷團(tuán)更緊密，呈綠色，而培養(yǎng)基C中所出愈傷團(tuán)以白綠色為主（圖1）。愈傷組織褐化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基中褐化愈傷團(tuán)主要為帶外植體殘留接種的愈傷團(tuán)，而去除了殘留外植體后的愈傷團(tuán)能有效降低愈傷組織褐化率。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)有關(guān)非洲菊愈傷誘導(dǎo)的研究主要集中在非洲菊的花托部位，而葉片及葉柄僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]。葉片作為非洲菊的營(yíng)養(yǎng)器官，取材方便且不受時(shí)間限制，本研究以非洲菊“水粉”的嫩葉為材料，探索了以非洲菊嫩葉不同部位為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的差異，愈傷誘導(dǎo)結(jié)果綜合顯示，嫩葉作為愈傷誘導(dǎo)外植體，其最佳取材部位為帶葉基的葉柄。該結(jié)論與周俊等[14]的研究結(jié)果一致，而與陳玉華等[15]的結(jié)果相異，究其原因，可能與非洲菊品種、愈傷誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基配方不同有關(guān)。

在大多數(shù)植物的愈傷組織誘導(dǎo)過程中，適當(dāng)加以一段時(shí)間的暗培養(yǎng)可以延緩?fù)庵搀w褐化，降低外植體死亡率并提高外植體出愈傷率[16，17]。本研究中加以不同時(shí)長(zhǎng)的暗處理盡管能減少外植體死亡率和提高愈傷組織的體積比，卻不利于葉片、葉柄外植體的出愈傷率。說(shuō)明光照能刺激外植體快速誘導(dǎo)出愈傷組織，該結(jié)果與非洲菊“大雪桔”品種的研究結(jié)果類似[18]，說(shuō)明非洲菊嫩葉的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)可以直接在光照條件下完成。

本研究中使用的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加了TDZ和2，4-D，葉片和葉柄均在15 d內(nèi)出現(xiàn)愈傷，且愈傷體積占比較高。而在戴云新等[19]的研究中，以添加了6-芐氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的MS培養(yǎng)基為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，葉片、葉柄在26 d后才出現(xiàn)愈傷，且愈傷量明顯低于花托。該結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)基中使用激素TDZ和2，4-D可能更適合非洲菊葉片、葉柄的愈傷誘導(dǎo)。非洲菊離體快繁中TDZ與2，4-D結(jié)合應(yīng)用的研究較少，因此該激素組合對(duì)非洲菊嫩葉離體快繁的作用還有待深入研究。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ在眾多植物的愈傷組織誘導(dǎo)中充當(dāng)著非常有效的細(xì)胞分裂素角色，但同時(shí)也給愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)帶來(lái)含水量增高等改變，且過高濃度的TDZ能導(dǎo)致后期的愈傷分化培養(yǎng)受抑[20]。本研究結(jié)果表明，TDZ含量較高時(shí)能有效誘導(dǎo)非洲菊嫩葉外植體出愈傷，而高濃度的TDZ培養(yǎng)不適宜愈傷組織的長(zhǎng)時(shí)間增殖，降低TDZ濃度能減少愈傷組織褐化死亡率，提高愈傷增殖能力并調(diào)整愈傷狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外有關(guān)2，4-D在非洲菊愈傷誘導(dǎo)中的作用報(bào)道較少。在張素勤等[21]的研究中，2，4-D比NAA和吲哚丁酸（IBA）對(duì)非洲菊葉片愈傷組織的誘導(dǎo)更快，植物生長(zhǎng)激素以1.0 mg/L的2，4-D誘導(dǎo)率最高，且形成愈傷組織最多，該結(jié)果與Mohlakola等[18]的結(jié)果一致。而本研究中使用的2，4-D激素濃度均不高，其與TDZ配合使用結(jié)果顯示，低濃度的2，4-D配合TDZ可以快速誘導(dǎo)出葉片、葉柄愈傷，而其對(duì)愈傷組織增殖的作用效果還需進(jìn)一步通過試驗(yàn)驗(yàn)證。

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