劉芳+廖先清+張志剛+周榮華+饒犇+張遵霞

摘要：利用單因素篩選和正交試驗(yàn)，對球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）NBIM-311高毒菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到其最佳培養(yǎng)基配方為魚粉20.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。通過200 L和5 000 L發(fā)酵罐分別發(fā)酵，發(fā)酵液對致倦庫蚊致死中濃度分別為0.963 mg/L和0.852 mg/L；發(fā)酵液經(jīng)過后處理所制備的原粉對致倦庫蚊致死中濃度分別為0.018 9 mg/L和0.022 3 mg/L。

關(guān)鍵詞：球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）；致倦庫蚊；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號：Q939.124 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4516-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.024

Abstract： The fermentation medium for highly toxic Bacillus sphaericus strain NBIM-311 against Culex quinquefasciatus was optimized through single factor screening and orthogonal experiments. The optimum medium was composed of 20.0 g/L fish meal，15.0 g/L corn steep liquor，60.0 g/L peanut meal，7.5 g/L yeast extract，1.0 g/L Calcium carbonate，0.3 g/L Magnesium sulphate and 0.1 g/L Potassium dihydrophosphate. The pilot fermentation of the strain was successfully carried out in 200 L and 5 000 L fermentor，the LC50 of the fermentation broth were 0.963 mg/L and 0.852 mg/L respectively. The LC50 of the prepared raw powder obtained from post-treatment of the fermentation broth were 0.018 9 mg/L and 0.022 3 mg/L respectively.

Key words： Bacillus sphaericus； culex quinquefasciatus； medium； optimization

蚊蟲是重要的傳染病傳播媒介，化學(xué)殺蟲劑在蚊蟲防治中發(fā)揮了重要作用[1]。隨著蚊蟲抗藥性的發(fā)展及人們對環(huán)境安全的重視，研究者進(jìn)行了生物殺蚊劑的開發(fā)，發(fā)現(xiàn)了兩類重要的蚊蟲病原細(xì)菌，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，簡稱Bti）[2]和球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）[3]。與蘇云金芽孢桿菌以色列亞種相比，球形芽孢桿菌的殺蚊譜較窄，但其對庫蚊屬幼蟲的毒性更強(qiáng)，且在污水中的藥效維持時間較長，特別適用于污水中孳生的庫蚊屬幼蟲（淡色庫蚊和致倦庫蚊）的控制[4，5]。中國目前已有球形芽孢桿菌BS-10及C 3-41等菌株實(shí)現(xiàn)了商品化，并開展了大面積的應(yīng)用試驗(yàn)[6]。也有研究者對分離的球形芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化[7，8]。球形芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)受到其發(fā)酵水平的限制，目前應(yīng)用還不是十分廣泛。筆者在進(jìn)行殺蟲細(xì)菌的篩選研究中分離到一株對庫蚊幼蟲高毒的球形芽孢桿菌NBIM-311菌株，本試驗(yàn)主要選取來源廣泛、價格便宜的農(nóng)副產(chǎn)品作為原材料，對該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高發(fā)酵水平。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

本試驗(yàn)所用的球形芽孢桿菌NBIM-311菌株由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心菌種室分離篩選并保藏；斜面活化培養(yǎng)基為常規(guī)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；單因素篩選原料為9種常見的市售農(nóng)副產(chǎn)品：玉米粉、魚粉、酵母粉、玉米漿、工業(yè)蛋白胨、蠶蛹粉、花生粕、豆粕、酵母膏；致倦庫蚊4齡幼蟲由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素篩選 根據(jù)球形芽孢桿菌的營養(yǎng)特性，不能利用葡萄糖、蔗糖等糖類物質(zhì)，只能利用蛋白質(zhì)、氨基酸等作為能源物質(zhì)[9]，選取玉米粉、魚粉、酵母粉、玉米漿、工業(yè)蛋白胨、蠶蛹粉、花生粕、豆粕、酵母膏作碳氮源，各原材料用量均為50.0 g/L，玉米漿用量按干物質(zhì)含量折算，滅菌前pH 7.5，分裝于500 mL三角瓶，每瓶裝量25 mL，滅菌30 min。挑取一環(huán)菌苔接種于搖瓶中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度30～32 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)至芽孢40%分離時下?lián)u床，發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢和生物測定。

1.2.2 正交試驗(yàn) 選取魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏作碳氮源，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)（表1），無機(jī)鹽保持不變，分別為碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L，按表1各濃度要求配制培養(yǎng)基，滅菌前pH 7.5，分裝于500 mL三角瓶，每瓶裝量25 mL，滅菌30 min。培養(yǎng)條件同“1.2.1”，發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢和生物測定。

1.2.3 200 L發(fā)酵罐發(fā)酵 按正交試驗(yàn)篩選到最佳培養(yǎng)基組分配制好培養(yǎng)基，投料體積120 L，消泡劑2.0 g/L，滅菌前pH 7.5，1×105 Pa滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入經(jīng)80 ℃水浴20 min的孢子懸浮液，通氣比1∶0.5～1.2，罐壓0.5×105 Pa，培養(yǎng)溫度30～32 ℃，發(fā)酵過程中取樣鏡檢，芽孢40%分離時結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液pH調(diào)至4.5，過100目篩，臺式離心機(jī)離心，3倍濃縮，所得菌漿冷凍干燥得到原粉，對發(fā)酵液和凍干粉進(jìn)行生物測定。

1.2.4 5 000 L發(fā)酵罐發(fā)酵 按正交試驗(yàn)篩選到最佳培養(yǎng)基組分配制好培養(yǎng)基，投料體積3 000 L，消泡劑1.0 g/L，滅菌前pH 7.5，1×105 Pa滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入經(jīng)80 ℃水浴20 min處理的孢子懸浮液，通氣比1∶0.5～1.0，罐壓0.5×105 Pa，培養(yǎng)溫度30～32 ℃，發(fā)酵過程中取樣鏡檢，芽孢40%分離時結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液pH調(diào)至4.5，過100目篩，碟片式離心機(jī)離心，3倍濃縮后的菌漿經(jīng)高速離心式噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥，得到原粉，對發(fā)酵液和原粉進(jìn)行生物測定。

1.2.5 生物測定 供試蟲為致倦庫蚊4齡幼蟲，參照袁志明等[8]的方法進(jìn)行生物測定。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素篩選

NBIM-311菌株在不同的碳氮源培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表2。從表2中可以看出，魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏均能被較好利用，其中花生粕同步率最高95%，菌體形態(tài)好，魚粉、玉米漿其次，酵母膏同步率85%，菌體大小較一致，玉米粉、酵母粉、工業(yè)蛋白胨、蠶蛹粉、豆粕利用能力差，鏡檢極少量菌體。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏作進(jìn)一步試驗(yàn)的碳氮源物質(zhì)。

2.2 正交試驗(yàn)

魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果如表3和表4。從表3和表4方差分析結(jié)果表明，這4種原材料主效應(yīng)排序?yàn)轸~粉>酵母膏>花生粕>玉米漿。魚粉的F值為2.581，對發(fā)酵的影響最大，而玉米漿、花生粕對發(fā)酵的影響不是很大。確定最佳配方為魚粉20.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。

2.3 200 L發(fā)酵罐發(fā)酵

發(fā)酵周期31 h，發(fā)酵21 h時取樣鏡檢，孢囊形成率為95%，菌體大小整齊。放罐時取樣鏡檢， 40%左右脫落，營養(yǎng)體少，芽孢大小整齊。將發(fā)酵液和冷凍干燥粉進(jìn)行生物測定，發(fā)酵液對致倦庫蚊的致死中濃度為0.963 mg/L，冷凍干燥粉對致倦庫蚊的致死中濃度為0.018 9 mg/L。

2.4 5 000 L發(fā)酵罐發(fā)酵

在湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司車間進(jìn)行3個批次5 000 L罐發(fā)酵，離心濃縮，噴霧干燥得到原粉。分別對這3批發(fā)酵液和原粉取樣進(jìn)行生物測定，結(jié)果見表5。

3 小結(jié)與討論

通過單因素碳氮源篩選和正交試驗(yàn)，獲得NBIM-311菌株最佳培養(yǎng)基配方為魚粉20.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。筆者在采用單因素試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)以花生粕作為碳氮源所得到的發(fā)酵液的毒力較高，與管玉霞等[10]的結(jié)果類似。采用該配方進(jìn)行了200 L和5 000 L發(fā)酵罐試驗(yàn)，發(fā)酵液效價和經(jīng)過后處理所得原粉效價均達(dá)到較高水平。但該菌株在200 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵水平與其在5 000 L發(fā)酵罐的發(fā)酵水平存在差距，究其原因，筆者認(rèn)為可能與發(fā)酵過程中中間控制工藝包括培養(yǎng)溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速以及后處理過程中的濃縮和干燥方法等有關(guān)。擬對該菌株的發(fā)酵工藝和后處理工藝技術(shù)的優(yōu)化開展研究。

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