廖先清+劉芳+周榮華+饒犇+陳偉

摘要：利用單因素篩選和正交試驗(yàn)，對(duì)膠凍樣芽孢桿菌菌株NBF-266的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得到其最佳培養(yǎng)基配方為甘油0.8%，淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸鈣0.1%。通過400 L和5 000 L發(fā)酵罐分別發(fā)酵，發(fā)酵液芽孢產(chǎn)量分別為18×108 CFU/mL和15.8×108 CFU/mL，發(fā)酵液經(jīng)不同方式濃縮干燥，得到凍干粉和噴霧干燥粉芽孢產(chǎn)量分別為2 910×108 CFU/g和933×108 CFU/g。

關(guān)鍵詞：膠凍樣芽孢桿菌；芽孢產(chǎn)量；優(yōu)化；中試生產(chǎn)

中圖分類號(hào)：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）23-4513-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.023

Abstract： The fermentation medium for Bacillus mucilaginous NBF-266 strain was optimized through single factor screening and orthogonal experiments. The composition of the optimized medium was glycerin 0.8%， starch 0.6%， peanut meal 1.5%， calcium carbonate 0.1%. Pilot production of B. mucilaginous was carried out in 400 L and 5 000 L fermentor， spore yield of the fermentation broth were 18×108 CFU/mL and 15.8×108 CFU/mL respectively. The fermentation broth was concentrated and dried in two different ways， spore yield of the freeze-dried powder and spray drying powder were 2 910×108 CFU/g and 933×108 CFU/g respectively.

Key words： Bacillus mucilaginous； spore yield； optimization； pilot production

微生物肥料是一類通過活體微生物發(fā)揮肥效的特殊肥料[1]。膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginous）是一種能分解硅酸鹽礦物的特殊細(xì)菌，它因具有分解硅酸鹽礦物、溶磷、解鉀、固氮等和增強(qiáng)作物抗病能力等多種特點(diǎn)而被制成微生物肥料[2]，目前已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物，增產(chǎn)效果明顯[3]。但其生產(chǎn)工藝有待改變和提高，大多微生物肥料生產(chǎn)還在延續(xù)20世紀(jì)70和80年代的發(fā)酵后發(fā)酵液直接吸附或液體灌裝的生產(chǎn)模式，無后處理工藝[4]，致使產(chǎn)品活菌數(shù)和芽孢形成率均較低，貨架期也較短，增 產(chǎn)效果不穩(wěn)定。

近年來關(guān)于膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵條件多有研究，但針對(duì)該菌的中試發(fā)酵和濃縮干燥研究卻鮮有報(bào)道。因此本研究擬通過一株膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基、工藝條件進(jìn)行研究，并通過400 L小罐和5 000 L罐進(jìn)行中試驗(yàn)證，獲得可產(chǎn)生高密度活菌數(shù)和高芽孢率的發(fā)酵和濃縮干燥工藝，從而提高微生物菌肥產(chǎn)品中的有效活菌數(shù)和芽孢率，延長(zhǎng)貨架期，改善微生物肥料的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試膠凍樣芽孢桿菌菌株NBF-266由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 斜面活化培養(yǎng)：將保存于砂土管的菌種轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至全部形成孢子。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：挑取一環(huán)斜面菌苔接入發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵裝液量為50 mL/500 mL，32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至芽孢20%左右脫落。

1.2.2 分析方法 活菌數(shù)及芽孢產(chǎn)量測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定每單位體積或單位重量?jī)?nèi)含有的活菌數(shù)[5]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 碳源單因子篩選 固定氮源為2%豆粕粉，選取蔗糖、飴糖、糖蜜、甘油、淀粉等幾種常見的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物[6]作為碳源進(jìn)行篩選。

1.3.2 氮源單因子篩選 選取碳源單因素篩選中確定的最佳碳源，選用魚粉、蛋白胨、豆粕、花生粕等工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為氮源進(jìn)行篩選。

1.3.3 正交試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)確定膠凍芽孢桿菌的最佳碳氮源和中心水平，選取碳氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行4因子3水平正交試驗(yàn)，尋找最佳配方。

1.3.4 400 L罐發(fā)酵小試 利用單因素和正交試驗(yàn)得出的最佳配方，在400 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，投料體積240 L，消泡劑0.1%，滅菌前調(diào)pH至7.5，滅菌、降溫至35 ℃，接入200 mL孢子懸浮液，通氣量12 m3/h，罐壓0.5×105 Pa，32 ℃培養(yǎng)至芽孢脫落20%時(shí)放罐。發(fā)酵液實(shí)驗(yàn)室高速離心機(jī)離心5 000 r/min，10 min，棄去部分上清液，得到3倍濃縮液，濃縮液冷凍干燥得到凍干粉。

1.3.5 5 000 L罐發(fā)酵中試 采用優(yōu)化后的配方，投料體積3 000 L，消泡劑0.1%，滅菌前調(diào)pH至7.5，滅菌、降溫至35 ℃，接入1 000 mL孢子懸浮液，通氣量150 m3/h， 罐壓0.5×105 Pa，32 ℃培養(yǎng)至芽孢脫落20%時(shí)放罐。發(fā)酵液采用兩種方式處理：一是取少量發(fā)酵液實(shí)驗(yàn)室離心，得到3倍濃縮液，冷凍干燥；二是車間碟片式離心機(jī)離心，濃縮液經(jīng)離心式噴霧干燥塔噴霧干燥得到原粉。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源單因子試驗(yàn)結(jié)果

碳源的篩選試驗(yàn)如表1所示。不同碳源對(duì)活菌量及芽孢的形成有很大的影響，在分別以葡萄糖、甘露醇、乳糖、飴糖為碳源的情況下菌量小且均不能形成芽孢， 在淀粉中菌量最大但只有60%可形成芽孢，而在甘油、糖蜜等碳源中可形成芽孢，菌量可達(dá)4.7×108 CFU/mL。這可能是因?yàn)樵谌樘?、葡萄糖等還原性糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)過快從而積累生理酸性物質(zhì)，pH長(zhǎng)期低于6.0且很難回升，導(dǎo)致菌體無法形成芽孢直至衰老、自溶[6]。也有可能是因?yàn)樗傩荚础⒕w營養(yǎng)生長(zhǎng)過盛。綜合碳源的還原性和遲效性，選用甘油和玉米淀粉作為復(fù)合碳源[7]進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.2 氮源單因子試驗(yàn)結(jié)果

氮源的篩選試驗(yàn)如表2所示。從表2可以看出，除玉米漿粉外，這幾種有機(jī)氮源對(duì)膠凍樣芽孢桿菌產(chǎn)孢率影響并不大?；罹鷶?shù)差別較大，以花生粕、蛋白胨、玉米酒糟為氮源時(shí)菌量均超過10×108 CFU/mL，尤以花生粕為氮源時(shí)菌量18.5×108 CFU/mL。綜合芽孢產(chǎn)量、成本等因素，確定花生粕為最佳氮源。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取復(fù)合碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行4因子3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)的水平與因子的確定、正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析分別見表3、表4、表5。從表4和表5方差分析結(jié)果表明，這4種成分主效應(yīng)排序?yàn)楦视?gt;淀粉>碳酸鈣>花生粕。兩種碳源甘油、淀粉的F值分別為1.954、1.716，對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響最大，而花生粕和碳酸鈣對(duì)發(fā)酵的影響不是很大。確定最佳配方為甘油0.8%，淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸鈣0.1%。

2.4 400 L試驗(yàn)罐發(fā)酵

發(fā)酵周期39 h，發(fā)酵29 h取樣鏡檢，個(gè)別形成孢囊，菌體大小整齊。放罐時(shí)取樣鏡檢，芽孢50%左右脫落，大小一致，同步率98%。將發(fā)酵液和冷凍干燥粉分別進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，發(fā)酵液芽孢產(chǎn)量18×108 CFU/mL，3倍濃縮液凍干粉芽孢產(chǎn)量2 748×108 CFU/g。

2.5 5 000 L發(fā)酵罐發(fā)酵

發(fā)酵周期43 h，發(fā)酵34 h取樣鏡檢，大部分菌體膨大，菌體大小整齊。放罐時(shí)取樣鏡檢，孢子少量脫落，大小一致，同步率98%。將發(fā)酵液、冷凍干燥粉、噴霧干燥粉分別進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，結(jié)果見表6。5 000 L中試放大，相對(duì)于400 L罐，不論從孢子形成率、芽孢產(chǎn)量、發(fā)酵周期都相當(dāng)，證明中試放大方案是可行的。5 000 L發(fā)酵液噴霧干燥粉水平與冷凍干燥粉相差較大，可能原因有二：一是離心濃縮工藝中參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，離心過程中孢子隨著上清液流失較多；二是芽孢耐熱性能與其他芽孢桿菌有差異，噴霧干燥過程中有損失。

3 小結(jié)與討論

通過單因素碳氮源篩選和正交試驗(yàn)，獲得膠凍樣芽孢桿菌菌株最佳培養(yǎng)基配方為甘油 0.8%淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸鈣0.1%。采用該配方進(jìn)行了400 L和5 000 L發(fā)酵罐小試和中試試驗(yàn)，發(fā)酵液和濃縮干燥粉芽孢產(chǎn)量均達(dá)到較高水平，尤其是冷凍干燥粉最高達(dá)2 910×108 CFU/g，噴霧干燥粉達(dá)933×108 CFU/g，具備了工業(yè)化生產(chǎn)的條件。

小試和中試發(fā)酵水平相對(duì)于搖瓶發(fā)酵存在差距，究其原因，可能與發(fā)酵過程中中間控制工藝包括培養(yǎng)溫度、溶氧、pH控制等有關(guān)，下一步繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化。針對(duì)5 000 L發(fā)酵液噴霧干燥粉水平與冷凍干燥粉相差較大，將進(jìn)行后處理工藝技術(shù)的優(yōu)化，一是優(yōu)化濃縮和干燥工藝，二是濃縮干燥過程中添加保護(hù)劑，盡量減少后處理過程中的損失，提高收率。

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