程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉，朱萬友

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052;2.昌吉州林業(yè)有害生物防治檢疫局，新疆 昌吉 831100；3.新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,新疆 烏魯木齊 830083)

棗實蠅(CarpomyavesuvianaCosta)是全國林業(yè)檢疫性有害生物，是一種十分危險的新入侵的害蟲。2007年，首次在新疆吐魯番地區(qū)發(fā)現(xiàn)的重大檢疫性害蟲，系在新疆乃至全國棗產(chǎn)業(yè)上有著重要經(jīng)濟意義的害蟲。在2007年5月29日發(fā)布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中把棗實蠅列為我國禁止進(jìn)境的檢疫性入侵害蟲(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告，2007)[1-4]。棗實蠅屬雙翅目(Diptera)實蠅科(Tephritidae)實蠅亞科(Trypetinae)實蠅族(Trypetini)咔實蠅屬(CarpomyaCosta)。隨著中國經(jīng)濟的高速發(fā)展，國內(nèi)地區(qū)間和國際的商業(yè)貿(mào)易與人員往來日漸頻繁，造成棗實蠅的擴散概率越來越高。然而棗實蠅一旦入侵新的區(qū)域，往往會給入侵地的棗產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的后果，甚至是毀滅性的打擊。因此，在棗產(chǎn)業(yè)安全與植物檢疫中棗實蠅的檢疫鑒定愈來愈重要[5,6]。

本研究首次利用DNA克隆技術(shù)，將棗實蠅mtDNA COI基因以菌液形式長期保存，當(dāng)需要時可以取出培養(yǎng)提取質(zhì)粒，解決了在口岸實蠅鑒定中國外獲取標(biāo)本困難，或缺乏陽性對照的難題，為棗實蠅快速鑒定提供了材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棗實蠅蛹標(biāo)本分別采自4個地區(qū)：吐魯番市、KSS、HSX和HMS，其采集地，個體數(shù)量及采集時間見表1。

表1 不同棗實蠅種群的標(biāo)本采集地點、 個體數(shù)量以及采集時間

1.2 試驗方法

1.2.1 目標(biāo)片段常規(guī)PCR擴增 棗實蠅mtDNA COI基因目標(biāo)片段用引物Uea7和Uea10進(jìn)行PCR擴增獲得，PCR反應(yīng)體系：PCR擴增在定量梯度PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系： 10×Buffer2.5 μl，Mg2+2 μl，dNTP 2.5 μl，上下游引物各0.2 μl，1 UTaq酶(Takara)0.2 μl，模板DNA2.5 μl，加水至總體積25 μl。

PCR擴增條件：94 ℃/5 min，95 ℃/40 sec，48 ℃/30 sec，72 ℃/1 min，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μl在含溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠上電泳30 min(90 V)，在數(shù)字圖像分析儀上檢測結(jié)果[6-8]。

1.2.2 PCR產(chǎn)物純化 將50μl左右的DNA樣品用含溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠上電泳30 min(90V)電泳分離，電泳緩沖體系為TBE?；厥誅NA(片段大約為700 bp)；采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的Takara Agarose Gel DNA Purfication Kit Ver.2.0 code DV805A純化目的條帶。回收DNA溶于25 μlElution Buffer中。

1.2.3 載體連接 將純化的PCR產(chǎn)物與pGM-T 載體 (大連寶生物公司)連接，操作按說明書進(jìn)行，其中目的PCR片段7 μl， pGM-T 載體1 μl，10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl， T4 DNA Ligase (3 U/μl) 1 μl ，16 ℃過夜連接。

1.2.4 轉(zhuǎn)化 將5 μl連接液加入到50 μl新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化；將細(xì)菌涂布在90 mm平板上，在制平板之前1 LLB培養(yǎng)基中加100 μlIPTG(50 mg·mL-1)和200 μl 20 mg·mL-1X -gal，細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；平板在37℃下正向放置半小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。

1.3 檢測

1.3.1 常規(guī)檢測 重組克隆篩選一藍(lán)/白斑篩選，當(dāng)外源DNA片段插入到pGM-T中后，由于外源DNA的核酸序列在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物β一半乳糖苷酶ɑ片段的活性，因此重組克隆X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色[7]。

從平板中挑4個白斑克隆，置于4 mL LB-AMP培養(yǎng)基中，37 ℃，150 rpm過夜培養(yǎng)。采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提質(zhì)粒，用Elution Buffer中溶解DNA， PCR法進(jìn)行陽性克隆的篩選。采用的引物用UEA7和UEA10， PCR產(chǎn)物約700 bp。與克隆前PCR產(chǎn)物的大小一致，確定為陽性克隆。

1.3.2 酶切反應(yīng) 在10 μL 反應(yīng)體系中加入5 μL 質(zhì)粒， 酶ECORI 1 μL， 10×buffer1 μL ， 最后加ddH2O至10 μL ，將上述混合液置37 ℃水浴4 h。

1.3.3 快速檢測 挑取白色菌落直接進(jìn)行PCR檢測。

1.3.4 測序鑒定 使用常規(guī)檢測或快速方法進(jìn)行初步的鑒定后進(jìn)行序列的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗實蠅mtDNA COI基因片段克隆

本研究對四個地區(qū)棗實蠅的線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶I(COI)從M7至COOH之間約700 bp片段部分序列進(jìn)行克隆，分別獲得克隆片段的菌液和質(zhì)粒，菌液和質(zhì)粒均保存于-20 ℃。

2.2 DNA克隆片段常規(guī)PCR檢測

用四個地區(qū)棗實蠅的DNA克隆片段的質(zhì)粒直接作為模板，用引物Uea7和Uea10進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，以檢查克隆片段的大小，檢測結(jié)果如圖所示：可以看出500～750 bp之間大約700 bp目標(biāo)片段的位置有一條擴增帶，亮度差異表示模板濃度的差異。DNA確切濃度和純度通過核酸蛋白檢測儀來測定。見圖1。

M: DL2000 DNA Marker; 1: HSX棗實蠅，2: HMS棗實蠅, 3：吐魯番市棗實蠅，4：KSS棗實蠅圖1 Uea7/ Uea10 引物 PCR 模板 DNA 質(zhì)量電泳圖

2.3 酶切反應(yīng)

用酶ECORI進(jìn)行酶切反應(yīng)，取酶切產(chǎn)物5 μl在含溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠上電泳30 min(90 V)，結(jié)果如圖2所示：

M: DL2000 DNA Marker; 1: HSX棗實蠅，2: HMS棗實蠅, 3：吐魯番市棗實蠅，4：KSS棗實蠅圖2 酶切電泳圖

3 討論

在棗實蠅快速鑒定上棗實蠅克隆片段具有很大的應(yīng)用價值，在對未知的實蠅標(biāo)本任何蟲態(tài)(無論是成蟲還是卵、幼蟲、蛹)在進(jìn)行快速鑒定時，陽性對照可用棗實蠅的COI基因克隆質(zhì)粒，而含棗實蠅mtDNA COI基因的菌液可以長期保存，當(dāng)需要時可以取出培養(yǎng)提取質(zhì)粒。這樣就解決了在口岸實蠅鑒定中國外獲取標(biāo)本困難、或是缺乏陽性對照的難題，同時也為能夠進(jìn)行大規(guī)模的SYBR Green PCR實時熒光檢測提供了充足的實驗材料[6-9]。

[1] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.棗實蠅四個地理種群的線粒體Cytb基因序列分析[J].林業(yè)科學(xué),2014,50(3):144-150

[2] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉，等.棗實蠅特異引物PCR鑒定技術(shù)[J].林業(yè)科學(xué),2013,49(11):98-102

[3] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.棗實蠅及相關(guān)5種檢疫性實蠅PCR-RFLP快速鑒定技術(shù)[J].南京林業(yè)大學(xué),2014,38(1):183-185

[4] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.SYBR Green實時熒光PCR快速鑒定棗實蠅技術(shù)[J].林業(yè)科學(xué),2014,50(4):60-65

[5] 阿地力·沙塔爾,張偉,程曉甜,等.棗實蠅不同地理種群親緣關(guān)系研究[J].林業(yè)科學(xué)，2012,48(6):136-140

[6] 余道堅.檢疫性實蠅分子生物學(xué)快速鑒定技術(shù)的研究[D].北京:中國科學(xué)院研究生院(上海生命科學(xué)研究院),2005

[7] 申建梅,胡黎明,賓淑英,等.瓜實蠅嗅覺受體基因的克隆及表達(dá)譜分析[J].昆蟲學(xué)報,2011,54(3):265-271

[8] 申建梅,胡黎明,賓淑英,等.瓜實蠅普通氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及原核表達(dá)[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,30(4):455-460

[9] Jamnonglik W,Baimai V，Kittayapong P. Molecular evolut -ion of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based on the cytochrome oxidase I gene[J].Genetica,2003,119(1):19-25