邢 薇，姜 娜，李鐵梁，羅 琳，袁 丁，周 云，王 姝，馬志宏*

(1.北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100021)

免疫增強劑對血鸚鵡魚非特異性免疫的影響

邢 薇1，姜 娜1，李鐵梁1，羅 琳1，袁 丁1，周 云1，王 姝2，馬志宏1*

(1.北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100021)

【目的】研究菌蛻、殼聚糖、天蠶素、左旋咪唑4種免疫增強劑對血鸚鵡魚非特異性免疫的影響?！痉椒ā繉嶒灧譃?個實驗組和1個對照組，每個組設3個平行。實驗組分別投喂添加5％菌蛻、2‰殼聚糖、1‰天蠶素和0.25‰左旋咪唑的飼料，對照組為未添加免疫增強劑的基礎飼料，連續(xù)投喂血鸚鵡魚56d。分別于7d、14d、21d、28d、56d每個平行組中隨機取3尾魚，檢測血鸚鵡魚血漿中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(ALP)、補體C3和血液中呼吸暴發(fā)(NBT)活性?！窘Y(jié)果】投喂血鸚鵡魚菌蛻組分別在7d、21d、56d的呼吸暴發(fā)活性顯著高于對照組，在21dLZM活性顯著高于對照組，在56dALP的活性顯著高于對照組(P<0.05)。殼聚糖組在56d的呼吸暴發(fā)活性顯著高于對照組，在21dALP活性顯著高于對照組(P<0.05)。天蠶素組和左旋咪唑組只在56d呼吸暴發(fā)活性顯著高于對照組(P<0.05)?！窘Y(jié)論】在這4種免疫增強劑中，菌蛻能更好地提高血鸚鵡魚呼吸暴發(fā)、LZM、ALP活性，整體非特異性免疫效果要好于殼聚糖、左旋咪唑及天蠶素。

血鸚鵡魚；菌蛻；殼聚糖；天蠶素；左旋咪唑；非特異性免疫

血鸚鵡魚(Cichlasoma synspilum×C.citrine)是由雌性紫紅火口魚(Cichlasoma synspilum)和慈鯛科的雄性紅魔鬼魚(Cichlasoma citrinellum)雜交而來，屬淡水熱帶觀賞魚類。其嘴型似鳥喙，全身血紅亮麗，體態(tài)豐腴多樣，性情溫和，品種豐富等特點備受大家青睞，在觀賞魚市場中也占有著重要的一席之地[1]。近年來血鸚鵡的養(yǎng)殖規(guī)模不斷增大，但由于養(yǎng)殖技術(shù)不夠成熟，導致細菌性疾病和寄生蟲性疾病不斷發(fā)生，已嚴重威脅著血鸚鵡魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此做好血鸚鵡病害防治技術(shù)工作至關(guān)重要。

對血鸚鵡等觀賞魚的病害應該以預防為主，才能更好地增加其觀賞價值。國內(nèi)外學者對魚類免疫機制及其病害防治方法已進行了大量研究，其中免疫增強劑因能增強機體抗疾病感染的能力，其免疫增強作用所需時間較短，且沒有記憶成分，被認為是一種提高魚體免疫活性及疾病抵抗力的有效方法，具有重要的應用價值。免疫增強劑是指一些化學物質(zhì)、藥物、應激原或某些能引起特異、非特異性免疫反應活動、增強動物對病毒、細菌、真菌、寄生蟲等抵抗的物質(zhì)。目前免疫增強劑的種類可分為人工合成制劑、微生物來源制劑、動植物來源制劑、營養(yǎng)因子類物質(zhì)和生物活性因子類物質(zhì)等五大類[2]。魚類免疫增強劑主要通過增強非特異性免疫應答而發(fā)揮作用，如促進補體、溶菌酶、蛋白酶抑制劑、C-反應蛋白、天然溶血素、凝聚素、巨球蛋白、巨噬細胞活化因子和干擾素等的合成，活化巨噬細胞、嗜中性粒細胞、非特異性細胞毒性細胞的吞噬殺菌功能。另外，免疫增強劑也能提高魚體IgM抗體水平，增強魚類特異性免疫應答水平[3-4]。

口服免疫方式一直是研究的熱點，有研究者認為口服免疫更適合在生產(chǎn)中得到推廣應用[5-6]。本研究分別將菌蛻、殼聚糖、左旋咪唑、天蠶素4種免疫增強劑添加到飼料中，進行血鸚鵡魚投喂實驗，然后檢測血漿中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(ALP)、補體C3和血液中呼吸暴發(fā)(NBT)活性變化。旨在為免疫增強劑應用于血鸚鵡魚養(yǎng)殖業(yè)提供一定的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚

血鸚鵡魚由北京京朝花園養(yǎng)殖場提供。挑選體格健康、大小均勻的血鸚鵡魚225尾，平均體重為(90.14±3.82)g。

1.1.2 實驗飼料

血鸚鵡魚飼料購自北京友誼恒遠科技有限公司(該飼料為以魚粉和豆粕為主要蛋白源的商品化飼料，其中粗蛋白含量為40％、粗脂肪含量為6％)。

菌蛻組菌蛻的添加量根據(jù)前期實驗結(jié)果，采用5％濃度的維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)菌蛻(本實驗室制備的維氏氣單胞菌菌蛻，2.2×108cell/mL CLGS)的添加量。其他實驗組按照試劑說明推薦用量，分別是：殼聚糖組加2‰殼聚糖(青島海之源生物科技有限公司)；左旋咪唑組加0.25‰左旋咪唑(山東仁和堂藥業(yè)有限公司)；天蠶素組加1‰天蠶素(北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司)。將上述免疫增強劑分別添加到飼料中，攪拌均勻，陰干，作為實驗組。對照組為普通血鸚鵡魚飼料。

1.1.3 主要試劑及儀器

四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT)試劑(Amresco公司)；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(北京華英生物技術(shù)研究所)；補體蛋白3(C3)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(山東濰坊生物工程集團有限公司)；溶菌酶活力(LZM)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(德國羅氏診斷有限公司)。

羅氏全自動電化學發(fā)光儀檢測(德國，ROCHE/E601)；全自動生化儀(日本 HITACHI，7160型)；酶標儀(美國BioTek)；微孔板分光光度計(日本，Power WaveXS2)；臺式高速冷凍離心機(德國SiGmA3-18K)；渦旋混勻器(美國 IKA 2V S025)。

1.2 投喂實驗

實驗分為4個實驗組和1個對照組，每組設3個平行，每個平行組放置15尾血鸚鵡魚，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周，水溫27℃，持續(xù)充氧。實驗正式開始后，每日于 9∶00、13∶00 和17∶00 定時投喂 3次，按2％的投餌率進行投喂。養(yǎng)殖水溫控制在26℃±1℃，每天排污和換水各1次。24h不間斷充氧。實驗養(yǎng)殖桶容量為200 L。

1.3 樣品采集

分別在投喂免疫增強劑后的 7、14、21、28和56d時從每個平行組中隨機撈取3尾魚，進行尾靜脈采血。將血液放入1.5mL的離心管中(含有1.5％EDTA-Na2)上下顛倒混勻，然后取出100μL的抗凝血放入PCR管中，用于NBT的測定。剩余血液4℃，3 000r/min，離心10min，取上清置PCR管中，-80℃保存，用于 C3、LZM、SOD、ALP 的測定。

1.4 非特異性免疫指標的測定

1.4.1 呼吸暴發(fā)(NBT)

全血呼吸暴發(fā)活性的測定按硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT)方法[7]進行。

1.4.2 堿性磷酸酶(ALP)

采用比色法測定，用常規(guī)生化檢測法，德國羅氏全自動電化學發(fā)光儀檢測。

1.4.3 溶菌酶活力(LZM)

采用透光度比色法測定，在一定濃度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細菌細胞壁上肽聚糖使細胞裂解而濃度降低，透光度增強，在530nm處根據(jù)透光度的變化計算溶菌酶的含量。

1.4.4 補體C3測定

采用免疫比濁法測定，樣本中的補體C3與其相應的抗體在液相中結(jié)合，立即形成抗原-抗體復合物，并形成一定的濁度，利用全自動生化分析儀(波長340nm)測定C3濃度。

1.4.5 超氧化酶歧化酶(SOD)

采用比色法測定，利用鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境中發(fā)生自氧化反應，生成超氧陰離子自由基(O2-·)，并在其自氧化過程中產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，在450nm處比色測定此產(chǎn)物的生成量，推算出SOD的活力。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用STATISTIC 7.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用雙因素交互分析(Factorial ANOVA)，利用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫增強劑對呼吸暴發(fā)(NBT)的影響

在整個實驗過程中，呼吸暴發(fā)活性在各組均呈下降趨勢(見圖1)；其中在7、21、56d時菌蛻組呼吸暴發(fā)活性顯著高于對照組(P＜0.05)，殼聚糖組、左旋咪唑組和天蠶素組的呼吸暴發(fā)活性僅在56d時顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.2 免疫增強劑對血漿中ALP活性的影響

在整個實驗過程中，堿性磷酸酶(ALP)變化沒有顯著趨勢(見圖2)。實驗殼聚糖組的ALP活性在21d時出現(xiàn)峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)。菌蛻組的ALP活性在56d時出現(xiàn)峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 免疫增強劑對血漿中LZM活性的影響

在整個實驗過程中，溶菌酶(LZM)活性變化趨勢不顯著(見圖3)。實驗21d時，菌蛻組的LZM活性顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.4 免疫增強劑對血鸚鵡魚血漿中補體C3水平的影響

實驗結(jié)果見圖4。在整個實驗周期內(nèi)，各實驗組血鸚鵡魚血漿中的C3水平與對照組沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.5 免疫增強劑對血鸚鵡魚血漿SOD中活性的影響

在整個實驗過程中，各組的超氧化物歧化酶(SOD)活性沒有顯著變化的趨勢(見圖5)。28d時，菌蛻組的SOD活性顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 免疫增強劑對血鸚鵡呼吸暴發(fā)的影響Figure 1 Effect of immunostimulants on respiratory burst in Blood Parrot

圖2 免疫增強劑對血漿中ALP活性的影響Figure 2 Effect of immunostimulants on ALP in Blood Parrot

圖3 免疫增強劑對血漿中LZM的影響Figure 3 Effect of immunostimulants on LZM in Blood Parrot

圖4 免疫增強劑對血漿中補體C3水平的影響Figure 4 Effect of immunostimulants on C3 in Blood Parrot

圖5 免疫增強劑對血漿中SOD活性的影響Figure 5 Effect of immunostimulants on SOD in Blood Parrot

3 討論

魚類屬于較低等的變溫脊椎動物，其特異性免疫應答能力相對低下，因此，非特異性免疫在其免疫防御中具有重要意義[8-9]。本研究中的這4種免疫增強劑都能提高血鸚鵡魚的呼吸暴發(fā)活性，其中尤以菌蛻對魚體呼吸暴發(fā)的提高作用最為顯著和持久。另外，只有菌蛻提高了魚體LZM的活性，菌蛻和殼聚糖提高了魚體ALP的活性。在整個實驗期間，所有實驗組的C3活性與對照組相比都沒有顯著性差異。

魚體內(nèi)存在各種具有吞噬功能的細胞，如吞噬細胞、中性粒細胞和巨噬細胞，它們能夠利用活性氧來殺傷分子，將侵入機體的病原菌吞噬后，其膜內(nèi)結(jié)合的NAD(P)H氧化酶可以將分子氧轉(zhuǎn)化為超氧陰離子(O2-·)，這個過程稱之為呼吸暴發(fā)[10]。這種活性氧對于侵入機體的外來異物有很大的殺傷力，它可以獨立地與其他溶酶體酶類系統(tǒng)發(fā)揮作用[11]。呼吸暴發(fā)活性是衡量吞噬細胞殺菌能力的一個直觀指標，它與魚類非特異性免疫能力正相關(guān)[12]。在整個實驗過程中，各個實驗組和對照組的呼吸暴發(fā)整體呈下降趨勢，其原因目前不清楚，有待進一步研究。但是，在整體下降的過程中，菌蛻組的呼吸暴發(fā)活性在7、21、56d時顯著高于對照組(P<0.05)。由于呼吸暴發(fā)是魚體各種吞噬細胞吞噬過程的表觀反應指標，其活性的增加意味著體內(nèi)細胞免疫作用的增強；這與本研究中菌蛻組的LZM活性在21d時顯著高于對照組(P<0.05)結(jié)果相一致；因此推測菌蛻是通過激發(fā)細胞免疫，繼而激發(fā)出體液免疫因子(如LZM)的活性。殼聚糖組、左旋咪唑組和天蠶素組僅在56d顯著高于對照組(P<0.05)，與Lin等[13]在錦鯉中對殼聚糖的研究結(jié)果一致。整體來看，菌蛻能夠明顯加強機體吞噬細胞的吞噬作用，提升細胞免疫能力。

堿性磷酸酶(ALP)是一種重要的非特異性磷酸水解酶，是重要的解毒體系，并與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)[14]。魚類血液中的堿性磷酸酶對防御外界微生物入侵有積極意義。本研究中，殼聚糖組和菌蛻組分別在21、56d時能顯著增強血鸚鵡魚血漿中ALP的活性(P<0.05)，只是殼聚糖對魚體ALP的作用早一些，而菌蛻要晚一些。殼聚糖對血鸚鵡魚ALP的影響與仇高登[15]和劉云[16]的結(jié)果相同，仇高登發(fā)現(xiàn)復方烏梅殼聚糖在13～21d之間能顯著提高草魚血清堿性磷酸酶活性，劉云等用殼聚糖投喂刺參后15d的ALP活性極顯著高于對照組。張梁[17]等用蛭弧菌口服免疫草魚測定相關(guān)酶活性發(fā)現(xiàn)，實驗組血清ALP活性在42d時顯著高于對照組；且謝俊[18]等用滅活諾卡氏菌腹腔注射免疫烏鱧，6d到9d血清ALP顯著升高，且均顯著高于對照組；這些結(jié)果與本研究中的菌蛻結(jié)果基本一致。推測原因：魚類腸道中存在條件致病菌和各類益生菌，曾勇[19]曾發(fā)現(xiàn)健康草魚腸道中的氣單胞菌能夠分泌胞外酶，如淀粉酶，從而促進魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；本研究所用即為氣單胞菌的菌蛻，因此可能正是通過胞外酶促進了魚體的ALP活性。

溶菌酶(LZM)是魚類天然免疫系統(tǒng)中重要的非特異性免疫防御因子，在抵抗病原微生物感染中作用極為重要[20-22]，它能破壞細菌細胞壁結(jié)構(gòu)、使細菌內(nèi)容物溢出，從而殺死細菌，亦可誘導其他免疫因子的合成和分泌[23-24]。目前大多數(shù)學者認為，水生動物的非特異性免疫功能中，LZM活力與免疫功能呈線性正相關(guān)[25-26]。本實驗中，菌蛻組在21d LZM活性顯著高于對照組(P<0.05)，與A.siwicki等[27]、安利國等[28]和Ackerman等[29]一致。A.siwicki等用產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)和點狀氣單胞菌(Aeromonas punctata)感染7～14d時鯉魚血清LZM活力顯著升高；安利國等用豚鼠氣單胞菌滅活苗腹腔注射鯉魚1～7d后血清LZM活性顯著高于對照組；Ackerman等用微囊包裹的滅活細菌腹腔注射免疫虹鱒幼魚，5周后LZM活性顯著高于對照組。其原因可能是菌蛻能夠保留完整的外膜蛋白、菌毛、脂多糖、肽聚糖等免疫刺激成分[30]，能刺激吞噬細胞數(shù)量增加，提高吞噬功能，并將其釋放到外周血液中，增強活化的中性粒細胞向抗原部位的遷移[27]，吞噬細胞能夠合成和釋放出更多的LZM從而使LZM活性升高，提高了血鸚鵡魚的免疫功能[31]。

補體系統(tǒng)是機體非特異性免疫的重要組成部分。補體C3是連接補體經(jīng)典和旁路激活途徑的樞紐，能發(fā)揮溶菌殺菌、免疫調(diào)節(jié)、免疫復合物溶解等生物學功效，對于魚類是一種重要的防御機制[32-35]。本實驗中，各實驗組及對照組的補體C3活性之間無顯著性差異(P>0.05)，與周顯青等[36]研究結(jié)果相同。周顯青等發(fā)現(xiàn)維生素C只有在一定劑量范圍內(nèi)才能促進補體C3的合成，低于此范圍對補體的產(chǎn)生無影響，高于此范圍則產(chǎn)生抑制作用，且此劑量范圍在不同動物間存在一定差異。作者認為，本實驗補體C3的研究結(jié)果有可能與免疫增強劑的添加量有關(guān)。

超氧化物歧化酶(SOD)是動物機體內(nèi)重要的抗氧化酶[37]，是超氧自由基的天然消除劑,可以清除體內(nèi)多余的自由基,使自由基的形成與消除處于一種動態(tài)平衡,從而免除自由基對生物分子的損傷。SOD活性與動物機體的免疫水平密切相關(guān)，可用它們的活性變化作為機體非特異性免疫指標。本實驗中，菌蛻組的SOD活性在28d時顯著低于對照組(P<0.05)，與艾春香等[38]結(jié)論相同，添加VC后,河蟹不同組織中的SOD活性顯著降低了。艾春香等認為這是由于VC在河蟹機體內(nèi)也能很好地發(fā)揮抗氧化作用，使自由基在尚未發(fā)揮作用前就被清除了，導致誘導性酶SOD活性降低。作者認為關(guān)于水產(chǎn)動物機體中SOD酶活性受有關(guān)物質(zhì)影響的變化結(jié)果不一。正常健康機體內(nèi)自由基的形成和清除是處于一種動態(tài)平衡中，自由基不單有破壞作用，還有其對機體有利的一方面。而自由基的形成有生理性和病理性兩方面，自由基的清除由小分子和大分子自由基清除劑完成[39]。菌蛻的添加有可能激發(fā)魚體的其他自由基清除劑的產(chǎn)生，而導致SOD活性下降。該設想有待進一步試驗驗證。

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Effects of Immunostimulants on Non-specific Immune Response in Blood Parrot(Cichlasoma synspilum♀×Cichlasoma citrinellum♂)

XING Wei1，JING Na1，LI Tie-liang1，LUO Lin1，YUAN Ding1，ZHOU Yun1，WANG Shu2，MA Zhi-hong1*
(1.Beijing Fisheries Research Institute，Beijing 100068，China；2.Beijing Fisheries Technical Extension Station，Beijing 100021，China)

【Objective】A feeding experiment was carried out to determine the effects of four immunostimulants including bacteria ghosts，chitosan，cecropin and levamisole on the non-specific immune response of Blood Parrot(Cichlasoma synspilum♀×Cichlasoma citrinellum♂).【Method】The experiment was consisted of five treatments and conducted in cylindrical fiberglass tanks(200 L/tank)：bacteria ghosts(CLGs)group with 5％CL0901 bacteria ghost，chitosan group with 2‰ chitosan；cecropin group with 1‰cecropin；levamisole group with 0.25‰ levamisole and the control group with normal feed.Nine fish in each group were sampled for blood at 7，14，21，28 and 56 days，in order to test lysozyme(LZM)activity，superoxide dismutase(SOD)activity，alkaline phosphatase(ALP)activity，complement 3(C3)activity and respiratory burst(NBT)activity.【Results】The respiratory burst in CLGs group on 7，21，and 56d were significantly higher than the control group (P<0.05)，LZM activity of CLGs group on 21d and ALP activity of CLGs group on 56d were significantly higher than the control group(P<0.05).The respiratory burst in chitosan group on 56d and ALP on 21d were significantly higher than the control group(P<0.05).The respiratory burst in cecropin group and levamisole group on 56d were significantly higher than the control group(P<0.05).【Conclusions】These results indicated that the CLGs could enhance respiratory burst，lysozyme and alkaline phosphatase of Blood Parrot.Consequently，effect of the non-specific immunity of CLGs is better than that of chitosan，cecropin and levamisole.

Blood Parrot；bacteria ghost；chitosan；cecropin；levamisole；non-specific immunity

S965.8

A

1000-2650(2017)01-0099-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.01.015

2016-11-17

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市觀賞魚創(chuàng)新團隊(BAIC03-2017)；北京市自然科學基金(6152006)。

邢薇，女，大學本科，工程師，主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與病害研究，E-mail：xingwei2008cool@163.com；姜娜，女，研究生，高級工程師，主要從事水產(chǎn)動物免疫研究，E-mail：lidiaj0@126.com。姜娜與邢薇對本研究貢獻相同。*

馬志宏，女，大學本科，高級工程師，主要從事水產(chǎn)動物病害研究與防治技術(shù)研究，E-mail：mzh255@sohu.com。

(本文審稿：耿 毅；責任編輯：秦碧雯；英文審稿：劉益平)