婁興丹 張根林 葉邦策，2

（1. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003；2. 華東理工大學(xué)，上海 200237）

高富硒酵母的篩選及富硒強(qiáng)化研究

婁興丹1張根林1葉邦策1，2

（1. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003；2. 華東理工大學(xué)，上海 200237）

富硒酵母在醫(yī)學(xué)保健和制藥產(chǎn)業(yè)中有著重要的應(yīng)用，高富硒酵母是富硒酵母產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。以新疆富硒土壤為樣品來源，通過馬丁培養(yǎng)基的初篩和富硒能力的復(fù)篩，篩選到一株富硒量相對較高的黏紅酵母菌株Rhodotorula glutinis X-20。優(yōu)化了菌株的富硒培養(yǎng)條件，結(jié)果顯示，利用2%甘油為碳源可顯著提高酵母中硒的累積，培養(yǎng)12 h時添加50 μg/mL的亞硒酸鈉能夠保證酵母較高的硒累積量和生物量，添加0.4 mmol/L的磷酸鹽可以有效地促進(jìn)硒的轉(zhuǎn)運(yùn)和累積，最終使Rhodotorula glutinis X-20富硒量達(dá)到 5 009 μg/g。

富硒土壤；黏紅酵母；篩選；優(yōu)化培養(yǎng)

硒是人體和動物所必須的微量元素之一，能夠維持甲狀腺激素代謝、心血管系統(tǒng)、抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的正常功能［1］。研究發(fā)現(xiàn)，克山病、大骨節(jié)病、白內(nèi)障、糖尿病等40余種疾病均與硒缺乏有關(guān)［2］。我國屬于嚴(yán)重缺硒國家，國土面積72%地區(qū)的土壤硒元素缺乏（＜0.6 mg/kg），其中30%的地區(qū)嚴(yán)重缺硒［3］。當(dāng)前，硒的來源主要是通過飲食［4］，我國大部分人群平均每天攝入量26-32 μg，明顯低于世界衛(wèi)生組織制定的硒參考每天攝入量40-200 μg［5］。因此，富硒產(chǎn)品的發(fā)展對提高國民健康水平具有重要意義。

富硒酵母被認(rèn)為是一種安全有效的硒源，比無機(jī)硒更安全、更有效，通常用作營養(yǎng)強(qiáng)化劑［6］。目前發(fā)現(xiàn)的天然富硒酵母有釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、紅酵母和黏紅酵母等［7-10］，但天然富硒酵母常常富硒量不高，因此研究人員采用多種方法以提高酵母的富硒量，如優(yōu)化硒鹽添加周期、優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)工藝等。Ponce［11］曾經(jīng)在釀酒酵母的對數(shù)生長期和穩(wěn)定期添加不同量硒鹽，將富硒量提高了20%-30%；Suhajda［12］和 Yin［13］通過培養(yǎng)基 pH 值、溶氧量等條件的優(yōu)化，使釀酒酵母硒含量分別達(dá)到了1 200-1 400 μg/g和 639 μg/g。研究也發(fā)現(xiàn)，酸脅迫有利于促進(jìn)亞硒酸鈉的同化和生物轉(zhuǎn)化，使硒在酵母細(xì)胞中富集［14］；脈沖電場處理酵母細(xì)胞會提高酵母的耐受性或改變酶活性使富硒能力提高，細(xì)胞中的硒離子累積量增加了65%［15］。然而，由于目前各種酵母仍然存在富硒能力不穩(wěn)定、富硒量與生物量不適配等缺陷，仍是微生物富硒生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的瓶頸問題，與工業(yè)生產(chǎn)要求具有一定差異［11-12］。并且，一個酵母細(xì)胞理論上能夠結(jié)合的最大硒量依賴于細(xì)胞中甲硫氨酸和半胱氨酸（殘基）的含量，大約為6 000 mg/kg［16］，硒代氨基酸完全替代甲硫氨酸和半胱氨酸也是不可能的。要獲得高富硒酵母，進(jìn)一步篩選能在細(xì)胞內(nèi)積累大量硒蛋氨酸的酵母菌種仍然很有必要。為此，本研究以富硒土壤為基礎(chǔ)，篩選富硒酵母，期望通過研究培養(yǎng)基營養(yǎng)組分、硒鹽和微量元素等對酵母生長和硒富集的影響，優(yōu)化酵母培養(yǎng)工藝以提高酵母的硒含量，為富硒酵母的開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 選擇位于新疆天山北坡的富硒區(qū)域?yàn)闃悠凡杉攸c(diǎn)，主要采集石河子市和沙灣縣北部農(nóng)田區(qū)的中上等富硒土壤（經(jīng)檢測土壤中硒含量在0.6-8.2 mg/kg，包括新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)八師142團(tuán)12連、13連、14連、15連和16連（沙灣縣境）的葡萄園土壤）。每個采樣地隨機(jī)設(shè)置5個采樣點(diǎn)，采集地表面下5-10 cm適合微生物生長的土壤，總計(jì)采集50個樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 研究所用的培養(yǎng)基有馬丁培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基兩種。其馬丁培養(yǎng)基用于酵母的篩選，主要成分為：0.5%蛋白胨、1%葡萄糖、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%硫酸鎂、2%瓊脂、0.03%孟加拉紅溶液、0.01%氯霉素。YPD培養(yǎng)基用于酵母培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，主要成分為：2%葡萄糖、1%酵母粉和2%蛋白胨。在配置固體培養(yǎng)基時，額外加入2%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 為了篩選樣品中的酵母菌株，在150 mL錐形瓶中加入99 mL的無菌水和1 g的土壤樣品，放置到30℃、180 r/min的搖床中孵育12 h。然后吸取100 μL錐形瓶中的溶液加入到固體馬丁培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-5 d，由于馬丁培養(yǎng)基中含有鏈霉素，所以培養(yǎng)基上只能生長酵母菌與霉菌，并且酵母菌與霉菌在菌落形態(tài)上有較大差異，其中酵母菌菌落呈現(xiàn)粉紅色，邊緣為光滑、圓潤、凸起，而霉菌菌落呈現(xiàn)白色，邊緣為疏松、絲狀［17］。根據(jù)酵母菌株和細(xì)胞的形態(tài)特征，用肉眼觀察馬丁培養(yǎng)基生長的菌落，挑取培養(yǎng)基中形態(tài)較為光滑、圓潤的粉紅色菌落，進(jìn)而在顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)，最終確定是否為酵母細(xì)胞。

為了從眾多野生酵母中篩選出初始富硒能力較強(qiáng)的酵母菌株，選用在硒濃度為50 mg/L的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為36 h，培養(yǎng)溫度為30℃。利用原子熒光光度計(jì)檢測酵母中硒含量，同時用紫外分光光度計(jì)檢測其生物量。

1.2.2 酵母細(xì)胞中硒含量的測定 酵母細(xì)胞中硒含量采用原子熒光光度計(jì)進(jìn)行測定。吸取1 mL培養(yǎng)的酵母細(xì)胞于1.5 mL離心管中，離心收集菌體，用去離子水反復(fù)洗滌3次以洗去與酵母細(xì)胞未結(jié)合的硒離子和硒鹽，然后置于聚四氟乙烯坩堝中，加入10 mL混合酸及幾粒玻璃珠，浸泡過夜，使樣品冷消化，以免反應(yīng)過烈，導(dǎo)致樣品損失。次日，電熱板加熱消解，當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時，再繼續(xù)加熱至剩余體積2 mL左右。冷卻，加入5.0 mL 6 mol/L鹽酸，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，將Se6+還原成Se4+。冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，混勻備用。同時做空白試驗(yàn)，吸取10 mL試樣消化液于15 mL離心管中，加2 mL鹽酸，1 mL鐵氰化鉀混勻。

用原子熒光光度計(jì)（北京萬拓，AFS-820）檢測硒濃度，儀器參考條件為在負(fù)高壓340 V、燈電流100 mA、原子化溫度800℃、爐高8 mm、載氣流速500 mL/min、屏蔽氣流速1 000 mL/min、延遲時間1 s、讀數(shù)時間15 s和加液時間為8 s時，進(jìn)樣開始檢測，每個樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 富硒酵母的篩選與鑒定

通過馬丁培養(yǎng)基的初篩和富硒能力的富曬，從50個樣品中總共篩選到160株酵母菌株，從中選擇出一株生物量和富硒量均相對較高的X-20酵母為初始菌株，其初始富硒量為790 μg/g，生物量為4.64 g/L。

在YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)X-20酵母菌株，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中菌苔顏色由珊瑚紅逐漸變?yōu)槌燃t色，表面可由光滑到褶皺，有光澤，質(zhì)地粘稠。通過掃描電鏡觀察黏紅酵母形態(tài)特征（圖1），發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞呈卵形，寬度為3.5-5.0 μm，長度為6.0-10 μm，多邊芽殖。

對樣品的18S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序后提交至NCBI進(jìn)行BLAST序列比對，結(jié)果顯示，樣品基因序列與數(shù)據(jù)庫中的黏紅酵母基因序列的匹配度為99%，從而確定該樣品為黏紅酵母Rhodotorula glutinis，命名為X-20，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。菌株保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2017225。

2.2 營養(yǎng)組分對Rhodotorula glutinis X-20生長和硒富集的影響

2.2.1 碳源的影響 分別以2%的蔗糖、甘油、葡萄糖和果糖為培養(yǎng)基碳源，并在培養(yǎng)基中加入50 μg/mL的亞硒酸鈉培養(yǎng)Rhodotorula glutinis X-20，采用原子熒光光度計(jì)測定酵母的硒含量，結(jié)果如圖3所示。從黏紅酵母生長情況來看，葡萄糖和果糖效果較好，蔗糖次之，甘油較差（圖3-A）；從黏紅酵母富硒情況來看，甘油富硒效果最佳，而葡萄糖和果糖最低（圖3-B）。葡萄糖和果糖有助于黏紅酵母的生長，但富硒效果較差，雖然以甘油作為培養(yǎng)基碳源時，黏紅酵母的生物量較低，但其富硒量極高，考慮到本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑轲ぜt酵母的富硒強(qiáng)化，因此，選擇甘油作為培養(yǎng)基的碳源。

圖1 黏紅酵母的掃描電鏡圖

2.2.2 氮源的影響 分別以2%蛋白胨、硫酸銨、尿素和硝酸鈉為培養(yǎng)基中的氮源，在培養(yǎng)基中加入亞硒酸鈉對酵母進(jìn)行富硒培養(yǎng)，培養(yǎng)60 h后，采用原子熒光光度計(jì)測定酵母細(xì)胞的硒含量，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)?shù)鞍纂藶榈磿r，生物量和富硒量最佳。當(dāng)硝酸鈉為氮源時，生物量較好，但富硒量較低。當(dāng)硫酸銨和尿素為氮源時，酵母的富硒和生長情況均遠(yuǎn)低于蛋白胨。因此，選擇適宜酵母生長和富硒的蛋白胨作為培養(yǎng)基中的氮源。

圖2 菌株Rhodotorula glutinis X-20 18S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 碳源對Rhodotorula glutinis X-20生長和富硒的影響

2.3 硒鹽添加時間對Rhodotorula glutinis X-20生長和富硒的影響

分別在酵母細(xì)胞培養(yǎng)的第6 h、9 h、12 h、16 h和24 h向培養(yǎng)基中加入濃度為50 μg/mL的亞硒酸鈉，以甘油作為培養(yǎng)基碳源，以蛋白胨作為培養(yǎng)基中的氮源，對酵母進(jìn)行富硒培養(yǎng)。采用原子熒光光度計(jì)對實(shí)驗(yàn)樣品的硒含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示。從黏紅酵母富硒情況來看，硒鹽添加時間在12 h時富硒量最佳，為2 520.65 μg/g，生物量為4.21 g/L。酵母在24 h時添加硒鹽，富硒量最低。因此，確定硒鹽添加時間為12 h。

圖4 氮源對Rhodotorula glutinis X-20生長和富硒的影響

2.4 磷元素對Rhodotorula glutinis X-20生長和硒富的影響

以甘油為碳源，蛋白胨為氮源，第12 h為硒鹽添加時間，在培養(yǎng)初期分別添加不同濃度的磷酸鹽，研究磷元素對酵母富硒能力的影響，結(jié)果如圖6所示。磷酸鹽對黏紅酵母的生長和富硒能力有一定的影響。當(dāng)磷酸鹽濃度為0.1-0.4 mmol/L時，會促進(jìn)黏紅酵母的富硒。當(dāng)培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度為0.8-7.5 mmol/L時，高濃度的磷酸鹽對黏紅酵母的富硒產(chǎn)生了抑制作用。磷酸鹽濃度在0.4 mmol/L時富硒效果最佳，富硒量為5 009 μg/g，生物量為2.26 g/L。

3 討論

本研究在新疆富硒葡萄園中，通過馬丁培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到一株具有較好富硒能力的天然野生黏紅酵母菌株Rhodotorula glutinis X-20。據(jù)報道，黏紅酵母可以在細(xì)胞內(nèi)將亞硒酸鈉還原成Se0并富集［18］，納米膠體形式的Se0可以加強(qiáng)富硒酵母的抗氧化活性，并且還具有新的生物活性，如抗氧化劑、化療劑和化學(xué)預(yù)防劑［19］。另外，黏紅酵母可以廣泛合成工業(yè)生產(chǎn)中有價值的化合物，如類胡蘿卜素、脂類和酶［9］等，如由于黏紅酵母的脂肪含量高，可以將其作為飼料添加劑來替代魚粉用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中［20］。與其它普通酵母菌株相比，Rhodotorula glutinis X-20可以更好的吸收利用硒，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分和添加微量元素，最終使酵母的富硒量達(dá)5 009 μg/g，是目前報道中富硒量最高的。Ponce［11］、Marek Kieliszek［21］等通過探究酵母中硒的富集方式對于硒累積量的影響，得到酵母總富硒量分別為2 354 μg/g、1 841 μg/g；Suhajda［12］和 Yin［13］通過優(yōu)化培養(yǎng)基pH值等條件，使酵母中硒含量分別達(dá)到了 1 200-1 400 μg/g 和 639 μg/g。

圖5 硒鹽添加時間對Rhodotorula glutinis X-20生長和富硒的影響

圖6 磷元素對酵母富硒量和生物量的影響

研究發(fā)現(xiàn)甘油有利于黏紅酵母的富硒，可能與甘油通過3-磷酸甘油醛和部分少量的糖酵解代謝降解生成的乙醇和過氧化氫加強(qiáng)酵母細(xì)胞抵抗外界脅迫環(huán)境的生理機(jī)制［22］，并且調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓的平衡和氧化還原勢的平衡［23］有關(guān)。磷元素可以強(qiáng)化黏紅酵母的富硒能力，可能與酵母對硒的耐受性和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。有研究表明，高親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與低親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均參與硒的吸收，當(dāng)酵母細(xì)胞生長在低濃度磷酸鹽環(huán)境中時，高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pho84p參與硒的轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)酵母細(xì)胞處于高濃度磷酸鹽環(huán)境中時，低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pho87p和Pho90p 促進(jìn)硒的吸收［8，23］。

4 結(jié)論

本研究在富硒地帶的葡萄園土壤中篩選到一株初始富硒量較高的野生酵母菌株，經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，命名為Rhodotorula glutinis X-20。通過優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源、氮源，硒鹽添加時間，培養(yǎng)基的微量元素強(qiáng)化Rhodotorula glutinis X-20富集硒能力，最后將酵母菌株的富硒量提高到了5 009 μg/g。

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Screening of High Selenium-enriched Yeast and Enhancement of Its Selenium-enriched Capacity

LOU Xing-dan1ZHANG Gen-lin1YE Bang-ce1，2
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering，Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan，Shihezi University，Shihez 832003 ；2. Shanghai East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

Selenium yeast is important for health and pharmaceutical industry，and high selenium-enriched yeast is the basis for the development of selenium-enriched yeast products. In this study，Rhodotorula glutinis X-20 with relatively high amount of enriched selenium was screened from selenium-enriched soil of Xinjiang via preliminary screening with Martin medium and re-screening of selenium-enriching capacity. The optimal culture conditions were determined through single experimental factors. The selenium content enriched by the yeast was significantly improved by using 2% glycerol as carbon source. Supplying sodium selenite at 12 h of cultivation ensured the higher selenium content and biomass of the yeast. Addition of 0.4 mM phosphate efficiently increased the transport and accumulation of selenium，and ultimately the enriched selenium content by strain X-20 reached 5009 μg/g.

selenium-enriched soil；Rhodotorula glutinis；screen；optimized culture

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0604

2017-07-21

新疆兵團(tuán)科技攻關(guān)計(jì)劃（2016AB009）

婁興丹，女，碩士研究生，研究方向：微生物工程；E-mail：1009502440@qq.com

張根林，男，副教授，研究方向：代謝工程與合成生物學(xué)；E-mail：zhgl_food@sina.com

（責(zé)任編輯 李楠）