薛林貴 馬萍 尚海 何小燕 陳熙明 劉光繡 陳拓 張威

（1. 蘭州交通大學化學與生物工程學院，蘭州 730070；2. 中國科學院西北生態(tài)環(huán)境研究院沙漠與沙漠化重點實驗室，蘭州 730070）

魚類及兩棲動物抗菌肽的研究進展

薛林貴1，2馬萍1，2尚海1，2何小燕1，2陳熙明2劉光繡2陳拓2張威2

（1. 蘭州交通大學化學與生物工程學院，蘭州 730070；2. 中國科學院西北生態(tài)環(huán)境研究院沙漠與沙漠化重點實驗室，蘭州 730070）

目前，生物界成功分離750種抗菌肽，其中具有抗腫瘤活性的約占13.1%，源于兩棲動物和魚類分別約占13.3%和9.3%。魚類和兩棲動物抗菌肽均屬最原始脊椎動物，后天免疫系統(tǒng)極為脆弱，大部分依靠鰓、皮膚和腸道呼吸，主要依靠強大的先天固有免疫系統(tǒng)來避免病原菌侵染，因此分布在不同部位的抗菌肽便成了這類低等生物形成廣譜防御第一道防線的重要組成成分。綜述了具有廣譜抗菌活性和免疫調節(jié)能力的moronecidin、epinecidin-1、paradaxin、misgurin這幾種分布在雜交條紋鱸魚、條帶石斑魚、豹鰨魚和泥鰍的抗菌肽及臭蛙抗菌肽抗菌譜，如moronecidin可殺死所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌；epinecidin-1可有效預防石斑魚感染嗜鹽弧菌（Vibrio vulnificus）并殺死神經壞死病毒；paradaxin 具有抗腫瘤活性；misgurin殺菌能力極強，臭蛙抗菌肽能殺死白色念珠菌，總結了在畢赤酵母中成功表達的抗菌肽和源于魚類和兩棲動物中具有抗病毒和抗腫瘤活性的抗菌肽，探討了這幾種抗菌肽應用時存在的問題及解決方案，旨在為綠色、有效的抗菌肽藥物在各個領域發(fā)揮巨大潛力提供理論依據。

抗菌肽；抗菌譜；畢赤酵母

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是在外界條件刺激下，動物免疫防御系統(tǒng)產生的一類對外源病原體的致病作用具有免疫活性的多肽物質，是動物非特異性免疫防御的重要組成部分［1］。它是廣泛分布于細菌、植物、軟體動物、兩棲動物、魚類、鳥類和哺乳動物體內的小分子多肽，由20-60個氨基酸殘基組成［2］。自然抗菌肽不僅抗菌，而且還有細胞凋亡、傷口愈合和免疫調節(jié)的功能［3］。多黏菌素和短桿菌素是第一個用于臨床上黏膜感染的陽離子抗菌多肽，具有治療炎癥性皮膚疾病及改善傷口感染愈合的功能。近年來，國內外對抗菌肽的研究有了重大突破。例如，從吳郭魚（Oreochromis mossambicus）獲得的抗菌肽tilapia hepcidin 1-5和循環(huán)蝦抗內毒素因子（Cyclic shrimp anti-lipopolysaccharide factor，CSALF）能有效殺死石斑魚神經壞死病毒（GNNV）［4-5］；從日本鱟血細胞中提取到的抗菌肽Tachyplesin 1可有效抗貝類病原菌［6］；與現有已確定抗菌肽無結構同源性的水母抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制作用［7］。抗菌肽的殺菌機制為：帶正電的抗菌肽通過作用于細菌質膜磷脂分子上的負電荷，使膜發(fā)生去極化或形成“孔洞”，進入到細胞內作用于DNA或RNA，直接殺死細菌，從而產生抗菌活性［8］。有研究表明，影響抗菌肽的最關鍵因素是疏水性和兩親性，而肽鏈長度、電荷數并不起決定性作用［9］?？咕牡倪@種特殊抑菌機制很難使致病菌產生抗性和交叉抗性。

魚類的鰓、皮膚和胃腸道是病原微生物侵入的主要途徑，它能夠有效抵制感染的原因在于這些部位含有的豐富抗菌肽。例如，從泥鰍中分離到的misgurin，從冬季比目魚中分離到的pleurocidin和hepcidin，從豹鰨魚中分離到的 paradaxins，從石斑魚中分離到的epinecidin，從雜交條紋鱸魚中分離到的moronecidin和piscidin 4，從八目鰻魚中分離到的hagfish intestinal antimicrobial peptides，從黑鱸魚中分離到的dicentracin，從鯰魚中分離到的parasin和從大西洋八目鰻魚中分離到的hfiap-1等［10-13］。兩棲動物長期暴露的皮膚也含多種抗菌活性物質，如從蛙類皮膚腺體上提取到的受交感神經控制的多種藥理活性抗菌肽：使血管舒張增加通透性的速激肽（tachykinins）、具有心臟保護作用的緩激肽（bradykinins）、促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropinreleasing hormone、bombesin-like） 和作為免疫系統(tǒng)中重要的調節(jié)因子阿片樣肽（opioid peptides）［14-17］等。雨蛙（Hylachinensis）產生的雨蛙肽caeruleins，形成兩親性螺旋結構，是一種常見的功能和組成上類似于膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）的宿主防御肽，能夠刺激胃、膽管和胰腺分泌，降低高血壓和緩解腎絞痛、膽囊痛等［18］。這兩類動物體內或體表存在的抗菌肽迅速在先天固有免疫領域成為最新最熱門的研究。本文重點闡述魚類中的鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍抗菌肽及兩棲動物中的臭蛙抗菌肽的抗菌譜，提出這幾類抗菌肽能在畢赤酵母中成功異源表達的可能性，探討這幾類抗菌肽的應用前景。通過歸納總結這5類抗菌肽的相關基礎理論可以為后續(xù)該類研究應用提供參考依據。

1 鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽的抗菌譜

1.1 鱸魚抗菌肽的抗菌譜

Moronecidin是從雜交條紋鱸魚（Hybrid striped bass）鰓和皮膚中分離得到的含23個氨基酸殘基，經圓二色譜分析結構呈α-螺旋結構的抗菌肽［19］。預測信號肽（79個氨基酸）包括3個結構域：1個信號肽（22個氨基酸），1個C末端 prodomain區(qū)域（35個氨基酸）和成熟肽（22個氨基酸），該基因有3個內含子和4個外顯子［20］。Moronecidin抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、絲狀真菌（Filamentous fungi）和酵母，包括耐抗生素細菌，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant S.aureus）和耐萬古霉素糞腸球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis）。Moronecidin對單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、 表 皮 葡 萄 球 菌（Staphylococcus epidermidis）、 大 腸 桿 菌（E. coli）、 陰 溝 腸 桿 菌（Enterobacter cloacae）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、豬霍亂沙門菌（Salmonella choleraesuis）、小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）、白色念珠菌（Candida albicans）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）均具有較強抗菌活性。

1.2 石斑魚抗菌肽的抗菌譜

Epinecidin-1是從條帶石斑魚（Epinephelus coioides）的鰓和腸道中分離到，含21個氨基酸殘基保護魚類免受病原菌感染的一種抗菌肽。完整的epinecidin-1 cDNA 518 bp，預測含67個氨基酸的信號肽，包括3個領域：22個氨基酸的信號肽，25個氨基酸的成熟肽，和20個氨基酸的羧基末端pro區(qū)域，epinecidin-1基因含有3個內含子和4個外顯子［21］。一種酰胺化的成熟肽epinecidin-1具有很強的抗菌活性，對大多數水產病原菌如副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），多殺巴斯德氏菌（Pasturella multocida），溫和氣單胞菌（Aeromonas sobrio），摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、腦膜膿毒性黃桿菌（Flavobacterium meningosepticum）和大腸桿菌DH5α均有很強的殺菌能力，最低殺菌濃度小于5 μmol。Pan等［22］發(fā)現，石斑魚抗菌肽在已注射嗜鹽弧菌（Vibrio vulnificus）的石斑魚和羅非魚（Tilapia）中存活率顯著增高。

1.3 豹鰨魚抗菌肽的抗菌譜

Paradaxin是最早從豹鰨魚（Pardachirus marmoratus）體內分離得到的兩親性陽離子a-螺旋結構并具有穿膜作用的抗菌肽，含33個氨基酸殘基，具有抗腫瘤活性，該抗菌肽為離子型神經毒素［23-24］。Paradaxin分為 ParadaxinI、ParadaxinII兩種，是通過離子交換層析、反相高壓液相色譜法獲得的兩種抗菌肽。ParadaxinI和ParadaxinII分別占豹鰨魚腺體分泌蛋白的10%和8%，ParadaxinI的細胞毒性是ParadaxinII的5-10倍。Paradaxin對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抗菌活性，對綿羊紅細胞有溶血活性。

1.4 泥鰍抗菌肽的抗菌譜

Misgurin是由泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）產生的強堿性抗菌肽，含21個氨基酸殘基，其中含極性帶正電荷的4個賴氨酸和5個精氨酸殘基。泥鰍抗菌肽含有1個親水性甘氨酸對革蘭陰性菌的殺菌能力非常有效。此類抗菌肽由于不含半胱氨酸可折疊成疏水或雙親性α-螺旋結構。泥鰍抗菌肽的等電點為11.84，當pH＜pI時該蛋白質帶正電荷，正電荷的引入使抗菌肽的活性增強，而負電荷的引入可以使抗菌肽的活性減弱，適當的加酸可使抗菌肽的活性增強［25］。泥鰍抗菌肽濃度在10 μg/mL以下的時候對綿羊紅細胞沒有溶血活性。泥鰍抗菌肽能夠殺死大部分革蘭陽性菌，部分革蘭陰性菌及真菌，這種廣譜抗菌的特性是傳統(tǒng)抗生素無法比擬的。據Park［26］研究表明，misgurin及合成型misgurin的最低抑菌劑濃度相同，當泥鰍抗菌肽濃度為4 μg/mL時可抑制真菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；當泥鰍抗菌肽濃度為8 μg/mL時可抑制革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），同時可以抑制革蘭氏陰性菌如大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），還可抑制真菌如新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）；當泥鰍抗菌肽濃度為16 μg/mL時可抑制變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、沙雷氏菌（Serratia sp.）、白色念珠菌（Candida albicans）。

1.5 臭蛙抗菌肽的抗菌譜

臭蛙抗菌肽是從臭蛙皮膚上產生的含26個氨基酸殘基的生物活性肽，含帶負電荷的1個天冬氨酸和1個谷氨酸，含帶正電荷的3個賴氨酸和3個精氨酸。Conlon［27］認為蛙的皮膚表面分布大概250多種顆粒腺體，大部分集中在背部區(qū)域，合成和分泌多種抗菌活性的多肽，并認為這些多肽是多種基因復制的結果，形成兩性α-螺旋結構。蛙類抗菌肽家族十分龐大，包括brevinin-1、brevinin-2、esculentin-1、esculentin-2、ranalexin、ranatuerin-1、ranatuerin-2和temporin peptides等。

五種抗菌肽的抗菌譜及性質，如表1、表2所示。源于魚類和兩棲動物具有抗腫瘤和抗病毒活性的抗菌肽見表3。

2 抗菌肽在畢赤酵母中的表達

畢赤酵母是一種以甲醇為唯一碳源和能源的酵母，含有甲醇代謝所必須的酶，如醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）、二羥丙酮合成酶和過氧化氫酶［28］，利用畢赤酵母表達時使用最多的是pPIC9K載體，含強有力的啟動子AOXI，能快速篩選高拷貝整合轉化株，屬于表達外源蛋白最高的載體系列［29］。抗菌肽基因編碼根據畢赤酵母偏愛密碼子設計并用化學方法合成，基因克隆到表達載體再通過電擊法轉入到畢赤酵母，誘導并已成功表達的有：從冬季比目魚（Winter flounder）分離到的抗菌肽 Pleurocidin［30］，從墨西哥鱷梨果實中分離抗菌肽PaDef［31］，從雞中分離到的Fowlicidin-2［32］，從巨大天蠶中分離到的 Cecropin B［33］，合成天蠶素雜合肽 Cecropin A（1-8）-Melittin（1-18）［34-35］， 雜 合 抗 菌 肽 CA 和CB［9］等。鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽已在本實驗室用畢赤酵母成功表達。畢赤酵母表達抗菌肽，篩選表達量高的菌株，通過BMMY培養(yǎng)基加甲醇誘導獲得。通過對抗菌肽的研究，將有利于開發(fā)抗菌肽類藥物，緩解水產養(yǎng)殖遇到的急慢性疾病，避免抗生素帶來的直接或間接耐藥性。

表1 雜交條紋鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽的抗菌活性

表2 雜交條紋鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽的性質

表3 源于魚類和兩棲動物不同抗菌肽的功能比較

3 結語

泥鰍、鱸魚和石斑魚均屬于經濟魚類，集約化水產養(yǎng)殖造成的高密度生物量降低了它們抵抗疾病的能力進而引起巨額損失。雖然目前有幾種不同的疫苗已被開發(fā)，包括肌肉或腹腔注射重組蛋白、合成肽、滅活病毒、DNA疫苗、病毒樣顆粒來控制病情。但是，在大多數情況下，魚類感染病毒通常發(fā)生在早期階段（幼蟲和幼魚時），注射疫苗非常困難。因此，開發(fā)新的藥物來預防或治療病毒感染迫在眉睫?？咕淖鳛轭A防病原菌侵染的重要措施，不同的物種分泌的AMPS抗菌譜有所差異，可用于尋找新的治療耐病原體的藥物［43］。Li等［44］認為部分海洋無脊椎動物抗菌肽為多肽，通過研究刪除類似物的效果，發(fā)現許多有抗菌潛力抗菌肽局限于較小天然肽區(qū)。魚類和兩棲類抗菌肽大部分屬于小分子天然肽，因此活性相對較高并具有廣譜的抗菌活性，開發(fā)利用更具有實際價值。從魚源中分離的抗氧化劑和抗菌肽可作為食品配方中的功能成分，以促進消費者的健康和提高食品的保質期［45］。通過對抗菌肽的研究，未來將會減少漁業(yè)抗生素濫用、魚肉質量低、漁業(yè)養(yǎng)殖病害等問題?？咕淖鳛樾滦偷拿庖呋钚晕镔|應用于環(huán)境、食品、醫(yī)藥及水產養(yǎng)殖方面有巨大的潛力，有助于改善當前藥物的耐藥性、抗生素濫用、環(huán)境污染和食品污染等問題。

目前研究抗菌肽有待解決的問題：探索抗菌肽基因表達是否受病原體信號的調節(jié)，這種調節(jié)機制與皮膚上潛在的有益微生物競爭或抑制病原體的生長之間的微妙平衡是如何完成的；對于酵母重組表達的抗菌肽而言，pH、鹽濃度、溫度、消化酶是如何影響抗菌肽活性的；如何采用針對性的方法規(guī)模化生產和純化抗菌肽，提高抗菌肽在體內的穩(wěn)定性并應用于食品配料、醫(yī)藥和水產養(yǎng)殖方面。充分解決上述問題才能更好地應用市場發(fā)揮作用。

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Research Advances on Antimicrobial Peptides of Fish and Amphibians

XUE Lin-gui1，2MA Ping1，2SHANG Hai1，2HE Xiao-yan1，2CHEN Xi-ming2LIU Guang-xiu2CHEN Tuo2ZHANG Wei2
（1.School of Chemical and Biology Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070；2. Northwest Institute of Eco-Environment and Resources，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730070）

At present，750 antimicrobial peptides have been successfully isolated from the biological community，of which with antitumor activity account for about 13.1%. The antibacterial peptides derived from amphibians and fish are about 13.3% and 9.3%，respectively. Fish and amphibians are the most primitive vertebrate，and most of them rely on the gills，skin and intestinal breathing. Due to their extremely fragile acquired immune system，they have a powerful innate immune system to avoid the infection of the pathogen，thus the antimicrobial peptides distributed in different parts have become the important component of first defense line of broad-spectrum in these lower organisms. This paper reviewed the broad-spectrum antibacterial activity and immune regulation ability of antibacterial peptides such as moronecidin，epinecidin-1，paradaxin，and misgurin distributed in hybrid striped bass，Epinephelus coioides，Pardachirus marmoratus，and Misgurnus anguillicaudatusis，as well as antibacterial spectrum of smelly frog antimicrobial peptide. For instance，the moronecidin can kill all gram positive bacteria and some gram negative bacteria. Epinecidin-1 can effectively prevent the infection of vulnificus（Vibrio vulnificus）in grouper and kill the nervous necrosis virus. Paradaxin reveals the antitumor activities. Misgurin has strong bactericidal ability. Antibacterial peptides from the smelly frog can kill Candida albicans. Then，the paper summarized the antibacterial peptides successfully expressed in Pichia pastoris and those derived from fish and amphibian of having antiviral and antitumor activities. Finally，the paper discussed the problems and solutions in the application of these antibacterial peptides，providing a theoretical basis for green and effective antibacterial peptide drugs in various fields to play a great role.

antimicrobial peptides；antimicrobial spectrum；Pichia pastoris

2017-07-19

國家自然科學基金項目（31260135，31400437），甘肅省科技支撐計劃項目（1504FKCA015），蘭州市科技計劃項目（2015-3-68）

薛林貴，男，教授，博士生導師，研究方向：微生物工程，環(huán)境微生物；E-mail：xuelg@mail.lzjtu.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0599

（責任編輯 狄艷紅）