張 濤，雷幫星，何 勁，文曉鵬

( 1．貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，貴州省生化工程中心，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴陽學(xué)院，貴州 貴陽 550005)

煙草黑脛病拮抗菌的篩選鑒定及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

張 濤1，雷幫星1，何 勁2*，文曉鵬1

( 1．貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，貴州省生化工程中心，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴陽學(xué)院，貴州 貴陽 550005)

【目的】為篩選出對煙草黑脛病具有拮抗作用的細(xì)菌菌株，為煙草黑脛病的生物防治及生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎闷桨鍖χ欧êY選對煙草黑脛病有明顯抑制作用的細(xì)菌菌株，結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征及分子生物學(xué)特征對該菌株進行鑒定，并利用菌餅法對該菌株的培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】篩選出的菌株D1為革蘭氏陽性菌、短桿狀、產(chǎn)孢，且生理生化特征及16S rRNA基因序列與解淀粉芽孢桿菌具有極高的相似性(97 %)，因此確認(rèn)菌株D1為解淀粉芽孢桿菌。篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基為PD液體培養(yǎng)基，最優(yōu)碳源為蔗糖、氮源為蛋白胨、無機鹽為氯化鈣，最優(yōu)配比為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %；最佳培養(yǎng)條件為pH 7～8、培養(yǎng)時間42 h和裝瓶量30 %?！窘Y(jié)論】篩選得到的目的菌株通過發(fā)酵培養(yǎng)對煙草黑脛病有明顯的抑制作用，可作為生防菌開發(fā)利用。

煙草黑脛?。唤獾矸垩挎邨U菌；生物防治

【研究意義】煙草(Nicotianatabacum)是以收獲葉片為主的重要經(jīng)濟作物，是世界上種植最廣泛的非食用的葉用經(jīng)濟作物，同時，也是我國重要的經(jīng)濟作物之一。煙草黑脛病(Phytophthoranicotianae)是煙草常見病害，屬藻物界(Chromista)、卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、腐霉目(Pythiales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)，是世界煙草栽培中毀滅性的土傳病害。煙草黑脛病發(fā)病率高、傳染快、不易控制，在苗期和大田期均可發(fā)生，受染煙草整株死亡[1]?！厩叭搜芯窟M展】據(jù)不完全統(tǒng)計，我國煙草黑脛病平均每年發(fā)病面積高達76 373 hm2，產(chǎn)量損失近3×107kg，產(chǎn)值損失超過1.23億元[2]。目前，對煙草黑脛病的防治措施以栽培管理、抗病品種及化學(xué)防治為主，常用的氨基甲酸酯類(Carbamtes)和羧酸酰胺類(Carboxylic acid amides)等是我國煙草黑脛病防治的主要藥劑[3]?！颈狙芯壳腥朦c】隨著無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)規(guī)模的逐步擴大，生物農(nóng)藥的研究和開發(fā)越來越受到人們關(guān)注。利用微生物的拮抗作用開發(fā)新生物農(nóng)藥已成為國內(nèi)外研究的熱點[4]，對煙草產(chǎn)業(yè)有重要意義。劉暢等[5]通過實驗篩選得到1株哈茨木霉對煙草黑脛病有較好的拮抗效果，其抑菌率達84.34 %；馬冠華等[6]分離得到內(nèi)生菌Itb57，對黑脛病溫室內(nèi)防治效果為69.28 %，田間防治效果為61.25 %～72.49 %?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用平板對峙法研究貴州省生化工程中心分離保存的具有抗菌作用的細(xì)菌菌株(D1、Hd13、He14、He41、Hd213、F2、H3)對煙草黑脛病的生物防治效果，以期為豐富煙草黑脛病生物防治的微生物資源及其生物農(nóng)藥的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 拮抗菌株：D1、Hd13、He14、He41、Hd213、F2和H3等7株細(xì)菌菌株，由貴州省生化工程中心分離保存。病原菌株：煙草黑脛病菌(Phytophthoranicotianae)，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、PD培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液、大米培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的菌株的篩選 采用平板對峙法，在PDA平板中央接種5 mm煙草黑脛病菌菌塊，同時在平板4個邊點接目的菌株，每個處理3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～6 d后觀察抑菌效果。

1.2.2 目的菌株的鑒定 ①菌株生理生化試驗。根據(jù)文獻[7]中對細(xì)菌的鑒定特征，對其進行生理生化鑒定。②細(xì)菌DNA提取。采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA。用接種環(huán)挑取1個單菌落接種到15 mL試管中(裝液量為30 %)。置28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，置于1000 r/min室溫離心1 min，取沉淀，用1 mL無菌水洗2次，1000 r/min離心1 min，取沉淀，加100 μl TE(pH 8.0)重懸細(xì)胞，98 ℃水浴10 min，冰上放置5 min，2000 r/min離心1 min，取上清液，即為細(xì)菌DNA，于-20 ℃保存待用。③16S rRNA基因序列的擴增。采用細(xì)菌通用引物27 F和1492 R對樣品的16S rRNA基因序列進行PCR擴增，引物序列：27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系25 μl：27 F和1492 R各0.5 μl，模析DNA 1 μl，ddH2O 10.5 μl，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min，循環(huán)1次；94 ℃ 1 min，循環(huán)30次；55 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 1.5 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min，循環(huán)1次；-20 ℃保存?zhèn)溆?。④特異PCR法對菌株的鑒定。根據(jù)3種芽孢桿菌全基因組中β-甘露聚糖酶基因上下游設(shè)計3種特異性引物[8](表1)。特異PCR反應(yīng)擴增體系：引物各0.5 μl，DNA 1 μl，2×Mix 5 μl，ddH2O 3 μl。特異PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，循環(huán)1次；94 ℃ 30 s，循環(huán)35次；50 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min，循環(huán)1次；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化 ①單因素試驗。培養(yǎng)基種類：選取1.1.2中5種不同培養(yǎng)液，28 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)7 d，采用菌餅法做抑菌活性試驗，分析不同菌株培養(yǎng)液對抗煙草黑脛病菌抗菌活性的影響。碳源：分別以20 %的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、D-木糖、D-果糖和甘油替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，28 ℃、120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，比較不同碳源目的菌株抗煙草黑脛病菌活性的效果。氮源：在最佳碳源基礎(chǔ)上，分別以10 %的NH4NO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、脲素、CH3COO NH4、NaNO3和NH4Cl替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，28 ℃、120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，比較不同氮源目的菌株抗煙草黑脛病菌活性的效果。無機鹽：在最佳碳源和氮源基礎(chǔ)上，選擇MgSO4、檸檬酸鈉、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4和CaCl2無機鹽離子，28 ℃、120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，考察無機鹽對目的菌株抗煙草黑脛病菌活性影響的因素及最佳的水平組合。②正交實驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行3因素3水平試驗，具體因素及水平見表1。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件篩選 ①培養(yǎng)基初始pH。用濃度分別為10 % NaOH和10 % HCl的溶液將培養(yǎng)基初始pH調(diào)為3、4、5、6、7、8和9，以自然pH為對照，121 ℃滅菌30 mim。冷卻后接種目的菌株，120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，每個處理3次重復(fù)，計算抑菌率，篩選最優(yōu)初始pH。②培養(yǎng)時間。分別取培養(yǎng)6、12、18、24、30、36、42、48和54 h的發(fā)酵液進行抑菌實驗，每個處理3次重復(fù)，篩選最適培養(yǎng)時間。③培養(yǎng)溫度。分別設(shè)置溫度20、28、32和40 ℃，恒溫培養(yǎng)7 d，考察菌株發(fā)酵液對煙草黑脛病菌活性的影響，每個處理3次重復(fù)，測量菌塊直徑，篩選最適培養(yǎng)溫度。④裝瓶量。用300 mL培養(yǎng)瓶分別以裝瓶量為6 %、12 %、18 %、24 %、30 %、36 %和42 %接種目的菌株，120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，每個處理3次重復(fù)，得到目的菌株搖床培養(yǎng)最優(yōu)裝瓶量。

表1 芽孢桿菌全基因組中β-甘露聚糖酶基因引物信息

表2 培養(yǎng)基正交試驗因素及水平

1.3 統(tǒng)計分析

PCR擴增產(chǎn)物由北京賽諾基因有限公司完成測序，將所獲得基因序列在NCBI網(wǎng)址上進行Blastn比對，利用Mega 5軟件進行DNA序列排序，再用PAUP 4.0軟件分析，以最大簡約法(Maximum parsimony，MP)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。用Microsoft Excel 2007對所得原始試驗數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan新復(fù)極差法進行單因素試驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的菌株的篩選

從圖1看出，D1、Hd13、He14、He41、Hd213和H3等6株細(xì)菌菌株對煙草黑脛病菌均有一定的抑制作用，菌株F2對煙草黑脛病無抑制作用。抑制效果依次為D1>Hd213>Hd13>He14>He41>H3>F2，其中，以菌株D1的抑菌效果最為明顯，形成的菌落能有效抑制煙草黑脛病菌餅的生長和菌絲形成。

a為Hd213，b為D1，c為Hd13，d為H3，e為He14，f為He41，g為F2，h為對照a.Hd213; b.D1; c.Hd13; d.H3; e.He14; f.He41; g.F2; h.CK圖1 不同細(xì)菌菌株對煙草黑脛病的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different bacterial strains against P.nicotianae

a和b為菌落，c為革蘭氏染色，d為芽孢染色a and b.Colony; c.Gram staining; d.Spore staining圖2 菌株D1的菌落及顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 The colony and microstructure of strain D1

2.2 目的菌株D1的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 LB平板上，菌落呈圓形，為乳白色，有透明膠狀分泌物，中央凸起；28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后表面略粗糙，邊緣凸起；培養(yǎng)后期邊緣產(chǎn)生不明顯羽狀分枝。革蘭氏染色后于10×100光學(xué)顯微鏡下觀察，目的菌株呈桿狀，紫色；有芽孢，經(jīng)芽孢染色可見，芽孢呈綠色橢圓形，菌體呈紅色，初步鑒定為革蘭氏陽性菌(圖2)。

2.2.2 菌株D1生理生化及分子生物學(xué)特性 經(jīng)生理生化試驗，菌株D1的過氧化氫酶、水解淀粉、乙酰甲基甲醇、硝酸鹽還原、D-葡萄糖和甘露醇等試驗結(jié)果均表現(xiàn)陽性，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]，其生理生化特性與芽孢桿菌相符。

以菌株D1所提DNA為模板，用通用細(xì)菌引物(27F和1492R)進行PCR擴增，其目的條帶大小約1300 bp(圖3 A)，利用枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的特異引物進行特異PCR擴增，只有使用解淀粉芽孢桿菌特異引物能看條帶，且擴增片段與通用引物PCR結(jié)果相對應(yīng)(圖3B)，在1300 bp左右。將PCR產(chǎn)物進行測序，將其序列提交GenBank得到登錄號為GenBank KU761585。經(jīng)NCBI比對及構(gòu)建發(fā)育樹，菌株D1與解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensHQ840645)具有97 %的相似性(圖3C)，結(jié)合生理生化試驗結(jié)果確認(rèn)菌株D1為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.2.3 菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化 從圖4看出，PD培養(yǎng)液為最優(yōu)培養(yǎng)基，其抑菌率達62.27 %；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液其次，抑菌率為56.25 %。以PD培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，6種碳源培養(yǎng)液均能對煙草黑脛病菌產(chǎn)生抑制作用，其中蔗糖為最優(yōu)碳源，其抑菌率達66.53 %。以蔗糖為最優(yōu)碳源條件下，以蛋白胨為氮源的抑制效果最好，其抑菌率達69.36 %。不同無機鹽的培養(yǎng)基對煙草黑脛病均有明顯的抑制作用，其中以CaCl2的效果最好，其抑菌率達68.46 %。

從表3看出，3個因素對菌株D1抗煙草黑脛病菌的抑菌率活性影響為蔗糖>CaCl2>蛋白胨，其中蔗糖濃度對抗性顯著性(F=24.3>F0.05=19)影響。結(jié)合各影響因素得菌株D1抗煙草黑脛病的活性最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %。

2.2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 從圖5看出，初始pH、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和裝瓶量均對菌株D1發(fā)酵濾液抗煙草黑脛病菌活性有影響。

A為PCR 電泳圖，B為特異PCR電泳圖，C為16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，M為DNAmarkerA.PCR electrophoretogram; B.Specific PCR electrophoretogram; C.Phylogenetic tree for 16S rDNA sequence; M.DNA marker圖3 菌株D1的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Fig.3 Molecular biological identification of D1 strain

圖4 不同影響因子對發(fā)酵菌株D1的抑菌率Fig.4 Effect of different influencing factors on inhibition ratio of D1 strain against P.nicotianae

(1)初始pH。 pH 3～6(酸性條件)時抑制效果較差，7～9(中性或弱堿條件)時抑制效果較好，其中以pH 7.6(自然)對煙草黑脛病的抑制作用最好，因此以pH 7～8為解淀粉芽孢桿菌D1的初始pH。

(2)培養(yǎng)時間。隨著發(fā)酵時間延長培養(yǎng)液對煙草黑脛病的抑菌率呈先上升后下降趨勢，到42、48 h具有顯著的抑菌作用，54 h后抑菌活性下降。原因是發(fā)酵時間短，其生長周期不夠，處于遲緩期，產(chǎn)生的活性物質(zhì)較少，抑制效果較低；發(fā)酵時間長，由于底物濃度降低或細(xì)菌生長到衰亡期，所產(chǎn)活性物質(zhì)減少，因此選取42 h作為最佳培養(yǎng)時間。

(3)培養(yǎng)溫度。當(dāng)溫度為28 ℃時抑制效果最好，抑菌率達72.66 %；40 ℃時抑菌活性明顯降低。表明，溫度偏高不利于菌株生長，也不利于其抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，因此選擇28 ℃為菌株D1的最佳發(fā)酵溫度。

(4)裝瓶量。不同裝量對菌株D1發(fā)酵濾液抗煙草黑脛病菌活性的影響不顯著，其中以300 mL培養(yǎng)瓶裝瓶30 %的效果最好。

3 討 論

煙草黑脛病的病原菌為煙草疫霉菌，最早由VAN Breda de Haan 于1896年在印度尼西亞發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)20年代開始在美國發(fā)現(xiàn)，并迅速流行。我國煙草黑脛病分布范圍廣，福建發(fā)病率最高，此外，廣西、湖南、四川、貴州、云南等煙草產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為普遍[9]。煙草黑脛病菌菌絲最適生長溫度為28～32 ℃，4 ℃時可存活2個月，其孢子可在不良環(huán)境中存活3年以上，在煙株殘余組織上腐生時間在2年以上[10]。

本研究篩選得到對煙草黑脛病有拮抗作用的菌株D1為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌為革蘭氏陽性細(xì)菌，其抗逆性強，快速繁殖，在短時間內(nèi)可在有限的空間和營養(yǎng)競爭中占據(jù)優(yōu)勢，有效抑制病原菌的侵染；解淀粉芽孢桿菌主要通過分泌聚酮類、多肽類、脂肽類及抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)，對病原菌起抑制作用[11]。胡忠亮等[12]概述了解淀粉芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護上的應(yīng)用，并指出解淀粉芽孢桿菌具有分布廣泛、對人畜無害和不污染環(huán)境等優(yōu)點而成為生防菌的重要研究對象。

表3 菌株D1培養(yǎng)基的正交試驗結(jié)果

圖5 不同條件下菌株D1發(fā)酵濾液對煙草黑脛病菌的影響Fig.5 Inhibition effect of strain D1 fermented filtrated liquor on P.nicotianae under different culture conditions

菌株D1的最優(yōu)培養(yǎng)基為PD液體培養(yǎng)基，最優(yōu)碳源為蔗糖、氮源為蛋白胨、無機鹽為CaCl2，最優(yōu)配比為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和10 % CaCl2，最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH 7～8、培養(yǎng)時間42 h、溫度28 ℃和裝瓶量30 %。與洪鵬等[13]對解淀粉芽孢桿菌HF-01發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果存在差異，可能是菌株來源不同所致。

在生物防治中解淀粉芽孢桿菌已成為研究熱點的生防菌株，通過對菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化，使其處于最佳代謝期，產(chǎn)生較多抗菌活性物質(zhì)。本研究只是在搖床條件下對菌株D1 發(fā)酵培養(yǎng)基的類型、成分及其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，今后還需進行小試、中試，以驗證和完善發(fā)酵工藝，獲得適合發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝，在實際工業(yè)化生產(chǎn)中對發(fā)酵條件的控制方法還有待進一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究篩選到對煙草黑脛病有拮抗作用的菌株D1，其形態(tài)觀察、生理生化特征與解淀粉芽孢桿菌相似，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示菌株D1與解淀粉芽孢桿菌菌株B.amyloliquefaciensHQ840645具有97 %的序列同源性，并經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，確定拮抗細(xì)菌菌株D1為解淀粉芽孢桿菌。菌株D1發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為PD液體培養(yǎng)基，最優(yōu)碳源為蔗糖、氮源為蛋白胨、無機鹽為CaCl2，最優(yōu)配比為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %，最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH 7～8、培養(yǎng)時間42 h、溫度28 ℃和裝瓶量30 %(100 mL/300 mL)。

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ScreeningandIdentificationofAntagonisticStrainsagainstPhytophthoranicotianaeandItsFermentationProcessOptimization

ZHANG Tao1，LEI Bang-xing1，HE Jin2*，WEN Xiao-peng1

(1.Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education)，Guizhou Center for Biochemical Engineering，Institute of Agro-bioengineering/College of Life Sciences，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China; 2.Guiyang University，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】 The study aimed to screen bacterial strains with an antagonism againstPhytophthoranicotianaeand to provide the theoretical basis for biological control and bio-pesticide development ofPhytophthoranicotianae.【Method】The bacterial strains with an obvious inhibition effect againstPhytophthoranicotianaewere screened by the plate confrontation culture method. The screened strain was identified by morphological observation, physiological and biochemical property, and biological characteristics. The culture process of the screened strain was optimized.【Result】The screened D1 strain was a Gram-positive bacterium with a short bacilliform and spore-production. The similarity in physiological and biochemical property and 16S rRNA gene sequence between D1 stain andBacillusamyloliquefacienswas up to 97 %, which indicated that D1 strain wasBacillusamyloliquefaciens. The optimum medium for strain screening was PD + 20 g/L sucrose + 10 g/L peptone + 10 g/L CaCl2.The optimum culture conditions include pH 7-8, 42 hours and 30 % medium volume (100mL/300mL).【Conclusion】D1 strain with an obvious inhibition effect againstPhytophthoranicotianaecan be used for development and utilization of biological control bacteria.

Phytophthoranicotianae;Bacillusamyloliquefaciens; Biological control

1001-4829(2017)12-2717-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.017

2017-08-01

中國煙草公司貴州分公司技術(shù)開發(fā)項目“煙草白粉病生物防治及其田間關(guān)鍵配套技術(shù)”[(2014)2]

張 濤(1990-)，女，貴州遵義人，碩士，主要研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:420636545@qq.com，Tel：18798009305，*為通訊作者：何 勁，E-mail:jhe633@163.com

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