胡召杉，楊在君*，彭正松

(1.西華師范大學(xué)西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.西昌學(xué)院 農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013)

與小麥三雌蕊基因(Pis1)連鎖的SRAP標(biāo)記研究

胡召杉1，楊在君1*，彭正松2

(1.西華師范大學(xué)西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.西昌學(xué)院 農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013)

【目的】為了尋找與小麥三雌蕊基因Pis1連鎖的分子標(biāo)記?！痉椒ā坷么?8(CM28)與其三雌蕊近等基因系CM28TP雜交的F2群體為研究材料，采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合分組混合分析法(BSA)篩選與Pis1基因連鎖的分子標(biāo)記。【結(jié)果】①1936個SRAP引物組合在兩親本CM28和CM28TP中具有多態(tài)性的引物組合為224對，多態(tài)性引物比例為11.57 %；②利用三雌蕊池和正常池進(jìn)一步篩選得到m2e36和m16e26 2個與Pis1基因連鎖的SRAP標(biāo)記；③利用218個F2分離群體檢測，算出m2e36與Pis1基因的圖距為18.22 cM，m16e26與Pis1基因的距離為22.63 cM，這2個分子標(biāo)記分別位于Pis1 的兩側(cè)?！窘Y(jié)論】該結(jié)果為進(jìn)一步利用SRAP標(biāo)記進(jìn)行小麥基因定位奠定了基礎(chǔ)。

小麥；三雌蕊性狀；Pis1基因；SRAP標(biāo)記

【研究意義】小麥?zhǔn)堑湫偷膹?fù)穗狀花絮，其麥穗由多個小穗排列在主穗軸的兩側(cè)構(gòu)成，而小穗又是由著生于小穗軸上的3～5朵小花組成。正常情況下，小花由2個稃片、2個漿片、3個雄蕊和1個雌蕊組成，每朵小花結(jié)一粒種子。陳濟(jì)世先生最先在小麥中發(fā)現(xiàn)一朵小花結(jié)3粒種子的突變體，并將其命名為“三粒小麥”，但其親本無法確定[1]。“三粒小麥”又稱“多子房小麥”，它具有較多的可以在雜交小麥制種中利用的優(yōu)良性狀，如：穗粒數(shù)多，稃片開張，角度大等。彭正松教授等對“三粒小麥”進(jìn)行了多年的田間選育，最后培育出“三雌蕊品系(Three pistils，TP)”。TP性狀是由顯性核基因Pis1控制，與細(xì)胞質(zhì)遺傳無關(guān)[2-3]。因此，TP與Murai等人[4]發(fā)現(xiàn)的雄蕊雌蕊化品系的遺傳機(jī)制不同，且TP具有3個正常的雄蕊和3個可育的雌蕊，一朵小花能結(jié)3粒種子，顯著增加了小麥的穗粒數(shù)，因而具有較高的育種學(xué)價值。利用微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)已將Pis1基因定位于2D染色體的長臂上(2DL)，位于SSR標(biāo)記Xgwm539和Xgwm349之間。但Pis1基因距離SSR標(biāo)記Xgwm539和Xgwm349均較遠(yuǎn)，分別為：17.6和19.5 cM[5]。雖然TP的遺傳基礎(chǔ)基本清楚，但控制三雌蕊性狀發(fā)生的Pis1基因的DNA序列信息尚不清楚。要準(zhǔn)確克隆Pis1基因，最有效的方法就是圖位克隆，而實(shí)施圖位克隆的首要任務(wù)是找到與Pis1基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。目前用于小麥基因定位的分子標(biāo)記主要是SSR標(biāo)記，但SSR標(biāo)記在小麥基因組中數(shù)量有限無法滿足基因的精細(xì)定位要求，因此必須在小麥中開發(fā)新的分子標(biāo)記。【前人研究進(jìn)展】SRAP(sequence-related amplified polymorphism)標(biāo)記是Li等[6]開發(fā)的一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記。SRAP標(biāo)記具備RFLP、RAPD、SSR和AFLP 等分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，同時也克服了上述分子標(biāo)記的缺點(diǎn)，該分子標(biāo)記不僅有效和可靠，且使用成本較低。SRAP標(biāo)記在設(shè)計(jì)引物時正反引物分別針對DNA序列相對保守的外顯子與變異較大的內(nèi)含子、啟動子與間隔序列，因此，多數(shù)SRAP標(biāo)記在基因組中的分布是均勻的[7]。目前，SRAP標(biāo)記已廣范應(yīng)用于遺傳多樣性研究[8-11]，遺傳圖譜的構(gòu)建[12-13]和基因克隆[14]等方面。然而，與小麥功能基因連鎖的SRAP標(biāo)記研究尚未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究擬篩選與小麥三雌蕊基因Pis1連鎖的SRAP標(biāo)記。【擬解決的關(guān)鍵問題】為Pis1基因的克隆奠定基礎(chǔ)，同時也為其它功能基因的定位提供新的更為有效的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料為小麥三雌蕊近等基因系CM28TP和其輪回親本川麥28(CM28)，以及CM28與CM28TP雜交后的F2群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 F2群體的構(gòu)建 分別以CM28為母本和以CM28TP為父本配置雜交組合得到F1代種子。F1種植后套袋自交獲得F2群體。親本及F2群體的218個單株于2014年11月種植于西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田中，行距20 cm，株距10 cm，統(tǒng)一水肥管理。

1.2.2 性狀調(diào)查 性狀統(tǒng)計(jì)在小麥成熟期進(jìn)行，若一朵小花能夠結(jié)2?；?粒種子則記為三雌蕊性狀，若一朵小花只結(jié)1粒種子則記為正常雌蕊。

1.2.3 總DNA提取 采集親本及F2群體單株的幼嫩葉片，用植物多糖多酚植物DNA提取試劑盒(LABGENE，瑞士)提取其總DNA。

1.2.4 構(gòu)建BSA池 選取群體中的三雌蕊性狀單株和正常雌蕊性狀單株各10株，分別等量混合各株DNA，建立DNA三雌蕊池(P)和正常雌蕊池(N)。

1.2.5 SRAP標(biāo)記分析 采用Li等[6]發(fā)表的引物，包括44條SRAP正向引物和44條SRAP反向引物，共1936對引物組合(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系、程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染參照楊在君等[10]的方法。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)以條帶的有無作為區(qū)別不同基因型的標(biāo)志，并根據(jù)標(biāo)記在兩親本中的表現(xiàn)進(jìn)行歸類，將三雌蕊性狀中出現(xiàn)的帶型記為“a”，正常雌蕊中出現(xiàn)的帶型記為“b”，缺失數(shù)據(jù)記為“-”。標(biāo)記的命名采用引物組合的方式，如m16e26表示引物組合為Me16和Em26。

1.2.7 連鎖分析 利用Mapmaker3.0，設(shè)置LOD≥3.0，對標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，采用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離。利用Mapdraw繪制連鎖圖[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥三雌蕊性狀的遺傳分析

2.2 親本間多態(tài)性標(biāo)記的篩選

利用1936個SRAP引物組合(表1)對2個親本CM28和CM28TP進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1936對引物組合中有1926對引物組合(99.5 %)在兩親本中能擴(kuò)增出清晰的條帶，條帶主要分布在50～1000 bp之間。每對引物組合擴(kuò)增出的條帶數(shù)目不等，擴(kuò)增最少的引物組合僅出現(xiàn)1個條帶，如Me19-Em37；最多的擴(kuò)增出21個條帶，如Me22-Em2。大部分引物組合能擴(kuò)增出3～9個條帶。在1926對引物組合中有224對的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，占所用引物的11.63 %。這224對引物組合共擴(kuò)增出371個差異性條帶。其中Me5-Em23產(chǎn)生的差異性條帶最多為7條，大部分引物組合產(chǎn)生1～2條差異性條帶。

2.3 Pis1基因定位

利用篩選出的224對在親本間具有多態(tài)性的引物組合對三雌蕊池和正常池進(jìn)行分析，其中引物組合Me2-Em36在三雌蕊DNA池中產(chǎn)生1條特異性條帶(記為m2e36)，Me16-Em26在正常雌蕊DNA池中產(chǎn)生1特異性條帶(記為m16e26)。用建庫的20個單株對2個標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果2個引物組合特異性明顯，Me2-Em36引物組合在10個三雌蕊單株中，8株擴(kuò)增出100 bp左右的特征條帶；在10個正常雌蕊單株中，6株無該條帶，4株有條帶(圖1)。Me16-Em26引物組合在10個正常雌蕊植株中，9株擴(kuò)能增出1條約80 bp的特征條帶，1株無條帶；在10個三雌蕊單株中，9株無條帶，1株有條帶(圖1)。利用Me2-Em36和Me16-Em26引物組合對F2群體218個單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用Mapmaker3.0計(jì)算遺傳距離，Mapdraw繪制連鎖圖，結(jié)果表明m2e36與Pis1的遺傳距離為18.22 cM，m16e26與Pis1的連鎖距離為22.63 cM。這2個分子標(biāo)記分別位于Pis1基因的兩側(cè)(圖2)。

表1 正向和反向SRAP引物序列

A：Em2-Me36擴(kuò)增結(jié)果；B：Em2-Me36擴(kuò)增結(jié)果；1：正常雌蕊DNA池；2：三雌蕊DNA池；3～12：三雌蕊單株；13～22：正常雌蕊單株A：The PCR results with primer Em2-Me36；B：The PCR results with primer Em2-Me36；1：Normal pistils DNA pools；2：Three pistils DNA pools；3-12：Three pistils plants；13-22：Normal pistils plants圖1 Em2-Me36和Em16-Me26在三雌蕊池和正常雌蕊池及建池三雌蕊、正常雌蕊單株間的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of three pistils and normal pistils DNA pools, 10 three pistils plants and 10 normal pistils plants with primer Em2-Me36 and Em16-Me26

圖2 Pis1基因與SRAP標(biāo)記的連鎖圖譜Fig.2 A linkage map of Pis1 gene base on SRAP markers

3 討論與結(jié)論

正常情況下，小麥一朵小花只結(jié)一粒種子，自陳濟(jì)世先生發(fā)現(xiàn)“三粒小麥”(多子房)以來，由于其具有穗粒數(shù)多、稃片開張、角度大等特點(diǎn)，引起了眾多學(xué)者的重視。沈光華等[16]利用小麥中國春單體和雙端體定位分析后認(rèn)為小麥多子房性狀受2個同效異位隱性基因控制，且這2個基因分別位于5DS和6BS染色體上。武軍等[17]認(rèn)為，小麥的多子房性狀是在三粒小麥細(xì)胞質(zhì)存在的前提下，由1對顯性核基因控制。馬守才等對不同來源的多子房小麥材料研究后發(fā)現(xiàn)多子房性狀既有顯性基因，也有隱性基因控制，而且這些基因均位于6B染色體上[18-19]。彭正松教授等對“三粒小麥”進(jìn)行了多年的田間選育，最后培育出“TP品系”。TP是由一對顯性核基因控制，與細(xì)胞質(zhì)遺傳無關(guān)[2-3]。利用SSR分子標(biāo)記已將控制三雌蕊性狀的Pis1基因定位于2D染色體的長臂上，位于SSR標(biāo)記Xgwm539和Xgwm349之間，距離Xgwm539 17.6 cM，距離Xgwm349 19.5 cM[5]。

由于小麥中SSR標(biāo)記數(shù)量有限，很難利用SSR標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，因此必須在小麥中開發(fā)新的分子標(biāo)記。SRAP標(biāo)記是Li等[6]人開發(fā)的一種新型的分子標(biāo)記，他曾利用SRAP標(biāo)記在油菜(BrassicacampestrisL.)中發(fā)現(xiàn)了一個與恢復(fù)基因連鎖的SRAP標(biāo)記。王瑜等人[20]篩選到了一個與苜蓿(MedicagostivaL.)褐斑病(GLS)抗性基因連鎖的SRAP標(biāo)記。張媛等人[21]從蘋果(MalusdomesticaB.)砧木中篩選出4個與蘋果砧木的耐鹽基因連鎖的SRPA標(biāo)記。王帥等[22]從亞洲百合(LiliumasiaticaHybrida)中篩選出一個與無粉性狀連鎖的SRAP標(biāo)記。迄今為止國內(nèi)外關(guān)于SRAP標(biāo)記用于小麥功能基因定位的報(bào)道較少。本研究從1936個SRAP引物組合中篩選出224個多態(tài)性引物組合，多態(tài)性引物比例為11.57 %。這比黃瓜的多態(tài)性引物比例(34.9 %)低[23]，這主要是由于本實(shí)驗(yàn)用于構(gòu)建F2群體的親本是一對小麥三雌蕊近等基因系CM28TP及其輪回親本CM28。用三雌蕊池和正常池進(jìn)一步篩選，得到m2e36和m16e26與Pis1基因連鎖的SRAP標(biāo)記。然后利用218個F2分離群體檢測，算出m2e36與Pis1基因的圖距為18.22 cM，m16e26與Pis1基因的距離為22.63 cM。

本研究雖然找到了2個與Pis1基因連鎖的SRAP標(biāo)記，但這2個標(biāo)記距離Pis1基因仍較遠(yuǎn)。使用更多的SRAP引物組合和開發(fā)AFLP、SNP等標(biāo)記，正在本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行，以尋找與Pis1基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，達(dá)到把Pis1基因精細(xì)定位與圖位克隆的目的。本研究雖然未能進(jìn)一步精細(xì)定位Pis1基因，但開發(fā)出了與Pis1基因連鎖的SRAP標(biāo)記，并在染色體上標(biāo)定出了SRAP標(biāo)記的位置，這為進(jìn)一步利用SRAP標(biāo)記進(jìn)行小麥的基因定位奠定了基礎(chǔ)。

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AnalysisofSRAPMarkersAssociatedwithThreePistilsGene(Pis1)inWheat

HU Zhao-shan1，YANG Zai-jun1*，PENG Zheng-song2

(1.Key Laboratory of Southwest China Resource Conservation (Ministry of Education), China West Normal University, Sichuan Nanchong 637009, China；2.College of Agricultural Sciences, Xichang College, Sichuan Xichang 615013, China )

【Objective】This paper aimed to identify the molecular markers linked to three pistils gene (Pis1) in wheat.【Method】The F2population produced by from the crossed of Chuanmai 28 (CM28) and its near isogentic line for three pistils CM28TP were used as materials. The molecular marker associated withPis1 was screened by bulked sergeant analysis (BSA) method and SRAP technology. 【Result】(i)224 pairs showed polymorphism among 1936 pairs of primer, the polymorphic percentage was 11.57 %; (ii) Two specific SRAP marker, m2e36 and m16e26 were found link toPis1 gene in three pistils and normal pistils DNA pool; (iii) After further analysis the 218 F2individuals foundPis1 gene located between the SRAP marker m2e36 and m16e26, 18.22cM distant from m2e36 and 22.63cM distant from m16e26. 【Conclusion】The results could offer the references for further mapping of wheat genes using SRAP markers.

Wheat; Three pistils character;Pis1 gene; SRAP markers

1001-4829(2017)12-2629-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.003

2017-01-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31760425)；西華師范大學(xué)英才基金項(xiàng)目(17YC355)

胡召杉(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種研究，E-mail: hzs20151209@163.com；*為通訊作者：楊在君，男，副教授，主要從事小麥遺傳育種研究，E-mail: yangzaijun1@126.com。

S331

A

(責(zé)任編輯陳 虹)