李鑫　李炎林　李清明　李文佳　蘇小軍

摘要：植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已廣泛用于生產(chǎn)次生代謝物，如多糖、皂苷、生物堿、黃酮類(lèi)及多酚等物質(zhì)。本文綜述了國(guó)內(nèi)外塊根塊莖類(lèi)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，內(nèi)容涉及懸浮體系方法、技術(shù)及其應(yīng)用領(lǐng)域等方面，同時(shí)初步討論大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝物問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：塊根莖類(lèi)植物；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；次生代謝物

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是將植物活體組織或離體組織培養(yǎng)物如愈傷組織、胚狀體等轉(zhuǎn)至合適的液體培養(yǎng)基中，置于特定轉(zhuǎn)速的搖床上進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)周期的繼代培養(yǎng)和篩選后形成穩(wěn)定均一的懸浮細(xì)胞系。植物細(xì)胞由于其分散性好、細(xì)胞形狀及細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，而且生長(zhǎng)迅速、重復(fù)性好、易于控制等有利因素，被廣泛用于細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及遺傳學(xué)、生物化學(xué)的研究。它不僅可直接用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交、基因轉(zhuǎn)移和生產(chǎn)次生代謝物等，還可短期內(nèi)在細(xì)胞水平篩選出預(yù)期突變體，因此，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已成為植物生物技術(shù)中最有用的手段之一。

塊根塊莖類(lèi)植物廣泛存在于大自然中，主要包括馬鈴薯、淮山、半夏、盾葉薯蕷、何首烏、人參、甘草、姜等品種，且多是藥食兼用植物，這類(lèi)植物根莖內(nèi)含有多種次生代謝物，如多糖、皂苷、生物堿、黃酮類(lèi)及多酚等物質(zhì)。近年來(lái)植物離體培養(yǎng)技術(shù)愈發(fā)成熟，利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)有效獲取代謝產(chǎn)物是一大研究熱點(diǎn)，但能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的植物不多。本文筆者對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)塊根塊莖類(lèi)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了綜述，內(nèi)容包括懸浮培養(yǎng)影響因子、方法和技術(shù)，應(yīng)用領(lǐng)域涉及突變體選取、次生代謝物提取和生物學(xué)研究；同時(shí)探討了工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝物存在問(wèn)題及其建議。

1植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

1.1懸浮體系影響因子

懸浮培養(yǎng)技術(shù)在植物次生代謝物大規(guī)模培養(yǎng)中得到了廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外在此方面已經(jīng)取得很大進(jìn)展。因此，了解影響懸浮培養(yǎng)的影響因子，對(duì)快速、準(zhǔn)確建立高質(zhì)量的懸浮體系具有重要意義。

1.1.1外植體選取。對(duì)于不同的植物，外植體選擇差異較大。塊根塊莖類(lèi)植物一般選擇用葉片、莖尖、芽尖、胚根等作為外植體。選擇合適的外植體，才能得到胚性愈傷率和再生率較高的再生體系，在胚性愈傷率較高的基礎(chǔ)上更容易快速建立起高頻再生的懸浮細(xì)胞系。

1.1.2愈傷組織誘導(dǎo)。塊根塊莖類(lèi)植物愈傷組織的誘導(dǎo)差異較大，一般植物外植體經(jīng)誘導(dǎo)后通常可產(chǎn)生3種類(lèi)型的愈傷組織：①質(zhì)地堅(jiān)硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織；②柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷組織；③質(zhì)地疏松、易分散、不分泌粘液的顆粒狀胚性愈傷組織。通過(guò)對(duì)愈傷組織有利誘導(dǎo)，為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供良好的基礎(chǔ)，有利于次生代謝物分泌。

1.1.3培養(yǎng)基成分?；九囵B(yǎng)基主要是無(wú)機(jī)鹽，而不同科屬的植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不盡相同，所以在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，對(duì)無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)及濃度要求也有所不同。植物主要常用的培養(yǎng)基有White、Heller、MS、ER、B5及N6等幾種。

培養(yǎng)基為塊根塊莖類(lèi)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)植物組織生長(zhǎng)、細(xì)胞分化和次生代謝產(chǎn)物積累等具有重要作用。其內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分主要包括碳源、氮源、有機(jī)物質(zhì)、無(wú)機(jī)養(yǎng)分、外源激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。

1.2懸浮培養(yǎng)方法和技術(shù)

植物細(xì)胞培養(yǎng)是在離體條件下，以單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)為單位進(jìn)行植物組織離體培養(yǎng)。該技術(shù)不受外界條件和性狀分離等影響，可在較短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)出較均勻的細(xì)胞，便于后續(xù)研究與利用。同時(shí)植物細(xì)胞需較長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程，需要長(zhǎng)時(shí)間保持無(wú)菌條件，培養(yǎng)過(guò)程中易造成污染且細(xì)胞常發(fā)生變異。植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)時(shí)對(duì)氧的需求量較低，但由于植物細(xì)胞培養(yǎng)后期密度高、粘度大，氧的傳輸會(huì)受到阻礙，因此與微生物相比，在達(dá)到同樣濃度時(shí)，氧傳遞速率要小得多。另外，植物細(xì)胞易于粘附成團(tuán)使攪拌不勻而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸受到限制，因而其二次代謝途徑更加復(fù)雜。

懸浮培養(yǎng)根據(jù)其培養(yǎng)方式可分為分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)2種類(lèi)型。分批培養(yǎng)是把細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，目的是獲得細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物；連續(xù)培養(yǎng)是利用特制的培養(yǎng)容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)不同的培養(yǎng)方法，其反應(yīng)器選擇也有差異。反應(yīng)器規(guī)模能否放大是選擇反應(yīng)器的一個(gè)重要前提，懸浮培養(yǎng)規(guī)模的放大主要通過(guò)增加反應(yīng)器體積或者增加反應(yīng)器數(shù)量，增大反應(yīng)器可以節(jié)省大量的配套工程及人員成本，而多臺(tái)小的反應(yīng)器雖然操作靈活，但成本相對(duì)高。目前國(guó)內(nèi)外用于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器主要有攪拌式、鼓泡式、氣升式、振動(dòng)混合式，此外還有植物固定化培養(yǎng)生物反應(yīng)器、光生物反應(yīng)器及一次性生物反應(yīng)器等。

選擇和配置生物反應(yīng)器還需考慮和滿(mǎn)足生產(chǎn)工藝和產(chǎn)能需求。反應(yīng)器接口的標(biāo)準(zhǔn)化、配件提供速度及售后服務(wù)質(zhì)量等，均應(yīng)作為工業(yè)化選用生物反應(yīng)器考慮的因素，以免造成生產(chǎn)的延誤n珂?？傊谥匾曋参镔Y源保護(hù)及有效利用的今天，合理利用植物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)植物中有效成分具有重要意義。

2植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域

通過(guò)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，利用懸浮細(xì)胞系主要應(yīng)用有：①選擇突變體，離體的單倍體體細(xì)胞可以提供一種突變體選擇系統(tǒng)，在很小的空間就可以操作大量潛在的植株。通過(guò)單細(xì)胞培養(yǎng)，可以在細(xì)胞水平上篩選出需要的突變細(xì)胞系，再生成理想的植株。②生產(chǎn)天然植物成分，懸浮培養(yǎng)物某些次生化合物含量往往比植物體高出2～5倍，通過(guò)植物細(xì)胞離體培養(yǎng)生產(chǎn)這些化合物，或利用培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)外供前體化合物或中間產(chǎn)物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。③原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交，懸浮細(xì)胞是分離原生質(zhì)體較理想的材料。④細(xì)胞生物學(xué)研究的工具，利用懸浮細(xì)胞進(jìn)行多方面細(xì)胞生物學(xué)研究。本文概述了塊根塊莖類(lèi)植物突變體選取、次生代謝物提取、生物學(xué)研究及開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品等方面。

2.1突變體選取

塊根塊莖類(lèi)植物種類(lèi)繁多，植物離體培養(yǎng)選取突變體方式也不一樣。經(jīng)報(bào)道潘梅等為選取優(yōu)質(zhì)幼苗，以山藥幼嫩莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)芽誘導(dǎo)最好培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭1.0g/L，組培苗移栽適宜基質(zhì)是V河抄：V椰糠：V珍珠巖=2：1：1。而Eun等選取MS+NAA 5.4μM+BA 4.44μM對(duì)半夏進(jìn)行懸浮培養(yǎng)大量繁殖試管塊莖，測(cè)定試管塊莖琥珀酸發(fā)現(xiàn)，含量最高達(dá)45g/kg，近乎于野生半夏琥珀酸含量，因此體外培養(yǎng)半夏試管塊莖，是一種選擇半夏塊莖突變體方法。Mingjun Li等進(jìn)行山藥體外培養(yǎng)生產(chǎn)試管塊莖試驗(yàn)，最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+KT 0.5rag/L+2，4-D0.1mg/L+PP₃₃₃ 0.1mg/L及60g/L蔗糖，每個(gè)植株可生產(chǎn)2～3個(gè)試管塊莖，大大加速了山藥繁殖。

2.2次生代謝物提取

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能高效合成許多重要價(jià)值的次生代謝物，傳統(tǒng)提取這些產(chǎn)物方式均是從天然植物中獲取，但天然植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，其生長(zhǎng)受地域和環(huán)境因素影響較大，利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能夠極大地彌補(bǔ)這些缺陷。

選擇合適培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞懸浮有利于次生代謝物分泌。楊帆等發(fā)現(xiàn)添加2mg/L 2，4-D+1mg/L NAA的MS培養(yǎng)基最適合馬鈴薯‘底西瑞懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞的最佳接種量為7.5mL/50 mL。張丹等建立人參懸浮細(xì)胞系，研究碳源、氮源、磷源及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)其影響，結(jié)果表明：MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA2.0mg/L+BA 0.4mg/L為最適培養(yǎng)基，接種量10g，100mL，19%，100r/min轉(zhuǎn)速條件下，人參懸浮細(xì)胞系生物量積累最大。Ewa等采用MS+2，4-D 1mg/L+NAA 1mg/L+BAP 0.5mg/L+50mg/L蔗糖液體培養(yǎng)基，利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究了西洋參6種皂苷的生物合成，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)25～30d之后，人參皂苷達(dá)到最高接近30mg/g·dw，但在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期皂苷的積累與生物量增加是不成比例的，在生物量快速增加達(dá)到90%時(shí)，僅有一半人參皂苷被檢測(cè)到，另一半皂苷在生物量緩慢增長(zhǎng)階段被積累。Narges等通過(guò)誘導(dǎo)元參愈傷組織及建立細(xì)胞懸浮體系，在體外生產(chǎn)阿克替苷。選取MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0m/L誘導(dǎo)愈傷組織，且誘導(dǎo)率達(dá)到100%，生長(zhǎng)最好愈傷組織中阿克替苷鮮重含量達(dá)到1.6μg/g。選取松散的、生長(zhǎng)較好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)17天后阿克替苷達(dá)到最大鮮重含量為14.25μg，g。Latiporn等進(jìn)行野葛根細(xì)胞懸浮培養(yǎng)獲取葛雌素、脫氧微雌醇及異黃酮，選取莖段愈傷組織在MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+BA 1.0m/L中進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)色烯和異黃酮干重含量分別為184.83±20.09μg，9、20.72±2.38mg/g。同時(shí)對(duì)不同碳源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在野葛根細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中選取蔗糖有利于生物量積累，而果糖有利于脫氧微雌酮和異黃酮分泌。

此外，一定程度誘導(dǎo)也有助于次生代謝物增加。陶興魁等對(duì)不同濃度EMS溶液對(duì)半夏懸浮細(xì)胞系進(jìn)行誘變處理，及耐高溫突變體篩選表明，半夏試管苗在高溫脅迫下，葉片內(nèi)游離脯氨酸含量升高，積累速度和積累量明顯高于對(duì)照組，可以把脯氨酸含量作為半夏抗高溫的生理指標(biāo)之一。卞愛(ài)華等發(fā)現(xiàn)在甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，添加水楊酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高鹽、超聲等誘導(dǎo)子有助于提高甘草酸含量。

2.3生物學(xué)研究

對(duì)于大多數(shù)塊莖類(lèi)植物而言，直接提取次生代謝物含量較低。隨著離體培養(yǎng)技術(shù)愈發(fā)成熟，近年來(lái)利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行生物學(xué)研究也取得一定成效。Eng等采用MS+2，4-D 2mg/L+NAA 1mg/L+BAP 1mg/L進(jìn)行凹唇姜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，采取蛋白質(zhì)組學(xué)分析經(jīng)苯丙氨酸誘導(dǎo)的提取物，發(fā)現(xiàn)了黃酮類(lèi)化合物及苯丙素類(lèi)的生物合成方式。同時(shí)許多研究者進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)方面報(bào)道，Man～n等通過(guò)甘草懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生的黃酮類(lèi)化合物及少量三萜烯，與栽種甘草中活性成分對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠水腫的抗炎效果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)抗炎效果相差無(wú)幾。Tanatorn等研究茉莉酸甲酯對(duì)野葛根細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生異黃酮和抗氧化物酶的影響，表明茉莉酸甲酯濃度為1.0μg/mL時(shí)，異黃酮含量最高，同時(shí)超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶在細(xì)胞中活動(dòng)水平均增強(qiáng)，而過(guò)氧化物酶減弱。因此野葛根細(xì)胞有抵御超氧化物和過(guò)氧化氫壓力的機(jī)制。Tanatornm 等選取細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（PMC）和塊莖根（PMT）獲取野葛根黃酮類(lèi)化合物，結(jié)果表明：切除卵巢的老鼠試驗(yàn)，PMT刺激雌激素活動(dòng)強(qiáng)于PMC；體外抑制破骨細(xì)胞試驗(yàn)，PMT和PMC提取物均能抑制抗破骨細(xì)胞活動(dòng)；DPPH法測(cè)定IC50值，PMT低于PMC。

2.4其他

塊根塊莖類(lèi)植物細(xì)胞培養(yǎng)中含有多種特殊的代謝產(chǎn)物，如黃酮類(lèi)、皂苷、多糖、生物堿及香精等活性成分。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物和活性成分已成為當(dāng)代生物技術(shù)的一個(gè)重要領(lǐng)域，特別是培養(yǎng)人參、何首烏等藥用植物細(xì)胞直接生產(chǎn)天然藥物研究已成為熱點(diǎn)。

3展望

利用現(xiàn)代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究和獲取植物代謝產(chǎn)物，能夠克服傳統(tǒng)上從天然植物中直接提取代謝產(chǎn)物存在的一些不足。目前盡管在懸浮培養(yǎng)調(diào)控培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、光質(zhì)、誘導(dǎo)子等影響次生代謝物積累方面的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，然而只有人參皂苷、紫草寧等少數(shù)植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。其主要原因在于，高產(chǎn)而又穩(wěn)定的細(xì)胞系難以篩選；植物細(xì)胞生長(zhǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，污染和褐化問(wèn)題難以徹底解決；植物細(xì)胞要求復(fù)雜，生物細(xì)胞反應(yīng)器工藝難以滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)要求；植物細(xì)胞培養(yǎng)成本高，代謝產(chǎn)物含量不穩(wěn)定，調(diào)控難度大。因此，利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)獲取次生代謝物還有待系統(tǒng)和深入研究。

隨著生物轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合生物技術(shù)獲取次生代謝物展現(xiàn)出誘人的發(fā)展前景。要實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化，需要重點(diǎn)開(kāi)展以下4個(gè)方面的研究：①獲取和篩選高產(chǎn)、穩(wěn)定的細(xì)胞系；②探索并掌握植物細(xì)胞次生代謝信號(hào)調(diào)控機(jī)制，合理、準(zhǔn)確地調(diào)控懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝；③改善植物生物反應(yīng)器的工藝和技術(shù)，提供植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適環(huán)境；④利用基因工程技術(shù)，對(duì)次生代謝中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行修飾和改造，提高次生代謝物的產(chǎn)量。