藍瑞隆，張 娜，陳瑞慶

(1．福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 中心實驗室，福建 福州 350005；2.福建省個體化主動免疫治療重點實驗室，福建 福州 350005；3．福建省血液病研究所 福建省血液病學重點實驗室 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001)

論著

MCT1和LDHB在荷乳腺癌小鼠髓系抑制性細胞中的表達及意義

藍瑞隆1,2，張 娜3，陳瑞慶1,2

(1．福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 中心實驗室，福建 福州 350005；2.福建省個體化主動免疫治療重點實驗室，福建 福州 350005；3．福建省血液病研究所 福建省血液病學重點實驗室 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001)

目的比較正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓中髓系抑制性細胞(MDSCs)的含量，探討其產生免疫抑制功能的可能機制。方法建立荷乳腺癌小鼠模型，利用BD FACSAria Ⅲ流式分選儀分選正常小鼠組和荷乳腺癌小鼠組骨髓中的MDSCs(CD11b+Gr-1+)，比較其含量；q-PCR法檢測兩組MDSCs中MCT1及LDHB的mRNA水平。結果荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs的比例為(48.92±3.13)%高于正常小鼠(25.13±1.95)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；荷乳腺癌小鼠MDSCs中MCT1的mRNA相對表達量(0.010±0.005)為正常小鼠(0.003±0.001)的3.33倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；荷乳腺癌小鼠MDSCs中LDHB的mRNA相對表達量(0.008±0.002)為正常小鼠(0.004±0.001)的2.00倍，差異極顯著(P<0.01)。結論MDSCs在荷乳腺癌小鼠骨髓中的比例顯著高于正常小鼠，其能量代謝關鍵分子MCT1、LDHB的表達也顯著高于正常小鼠。MDSCs的能量代謝特點可能正是其發(fā)揮免疫抑制功能的重要基礎。

MDSC； MCT1；LDHB；能量代謝；免疫抑制

髓系抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是骨髓來源的具有異質性的細胞亞群，是巨噬細胞、樹突狀細胞或粒細胞的前體，在腫瘤、感染、炎癥等病理條件下具有負向調控免疫應答的功能[1-3]。在腫瘤患者中，MDSCs可在IL-6、GM-CSF和 IL-1β等細胞因子的作用下，從骨髓遷移并募集至腫瘤的原發(fā)灶和轉移灶。MDSCs主要通過產生精氨酸酶1(arginase-1，ARG1)、誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等效應分子發(fā)揮免疫抑制功能[4-9]，既能抑制天然免疫反應，又能抑制適應性免疫反應。

能量代謝對于細胞的生物學功能發(fā)揮起著至關重要的作用，各項生物學功能依賴能量代謝水平的支持。單羧酸轉運體1(monocarboxylate transporter 1， MCT1) 是一種膜表面轉運蛋白，可將胞外的乳酸攝入到胞內，從而使得機體局部微環(huán)境的乳酸水平降低；乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenase B， LDHB)催化乳酸轉化為丙酮酸，丙酮酸最終進入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解[10-11]。已有許多報道證明MDSCs細胞亞群在許多人類腫瘤微環(huán)境中均大量擴增，在許多荷瘤小鼠中也大量存在。本研究從荷乳腺癌小鼠骨髓中分選出MDSCs(CD11b+Gr-1-)，并檢測其MCT1、LDHB的 mRNA水平，初步探討MDSCs產生免疫抑制功能的可能機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與耗材

q-PCR檢測試劑盒和RNA提取試劑盒均購自Promega； PE-anti-Mouse CD11b Antibody(Cat. # 101207)和FITC-anti-Mouse Gr-1 Antibody (Cat. # 108405)均購自Biolegend；BALB/c小鼠購自上海萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 方法與步驟

1.2.1 乳腺癌動物模型建立：購買4～6周齡的雌性BALB/c小鼠，飼養(yǎng)條件為SPF級。取對數(shù)生長期的小鼠乳腺癌細胞4T1(3×106)接種于腹部皮下脂肪墊，建立小鼠乳腺癌原位模型。約2周后，可見直徑約(13.00±2.00)mm大小的腫瘤。

1.2.2 分選小鼠骨髓中的MDSCs： 頸椎脫臼處死小鼠，取6只荷乳腺癌小鼠和6只正常小鼠后肢股骨和脛骨，去兩端膨大的關節(jié)頭至露出紅色骨髓，用1 mL注射器吸取生理鹽水沖出骨髓細胞。按照使用說明將PE-anti-Mouse CD11b Antibody和FITC-anti-Mouse Gr-1 Antibody 同時標記骨髓細胞，4 ℃孵育約40 min后離心棄上清，按約1.0×107/mL密度加入生理鹽水重懸骨髓細胞，采用BD FACSAria Ⅲ分選出MDSCs(CD11b+Gr-1+)細胞亞群。

1.2.3 q-PCR檢測MCT1、 LDHB的mRNA水平：參照試劑盒說明書提取分選出的MDSCs總RNA，利用ABI 7500 Real Time PCR System 行q-PCR檢測。所需引物序列如下：MCT1(101 bp)：F-5'-TGTGACCCACGACATCCAAA-3'，R-5'- TGAACACCCGGTAGGTTTTCC-3'；LDHB(102 bp)為：F-5'-ATTGCGTCCGTTGCAGATG-3'，R-5' -TCCCAGAATGCTGATG-GCA-3'；同時擴增內參β-Actin(138 bp)：F-5'-ATGGAATCC- TGTGGCATCCAT-3'，R-5'-TCCTGCATCCTGTCAGCAATG-3'。擴增條件：94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s ，35循環(huán)，采用2-ΔCt法計算各樣本的MCT1和LDHB mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 流式分選結果

圖1為正常小鼠和和荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs(CD11b+Gr-1+)的分選結果示意圖。

荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs的比例(48.92±3.13)%是正常小鼠(25.13±1.95)%的1.95倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。統(tǒng)計圖見圖2。

2.2 骨髓MDSCs中MCT1的mRNA水平

荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中MCT mRNA的相對表達水平(0.010±0.005)是正常小鼠(0.003±0.001)的3.33倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。統(tǒng)計圖見圖3。

2.3 骨髓MDSCs中LDHB的 mRNA水平

荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中LDHB mRNA的相對表達水平(0.008±0.002)是正常小鼠(0.004±0.001)的2.00倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。統(tǒng)計圖見圖4。

3 討 論

MDSCs是源自骨髓祖細胞和未成熟髓細胞的異質細胞亞群。正常生理狀態(tài)下，可以分化為成熟的粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞，進而發(fā)揮正常的免疫功能[1-3]。在病理狀態(tài)(如腫瘤、感染、炎癥等)下，該群細胞成熟受阻，停留在各個不完全分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs。已有許多報道證實，MDSCs在許多腫瘤(如乳腺癌、卵巢癌、腦膠質瘤、腎癌等)微環(huán)境中大量存在，和T-reg等組成機體免疫負性調節(jié)細胞，這是許多腫瘤預后不良的重要原因之一。

圖1 流式分選正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCsFig 1 FACS for MDSCs from bone marrow of normal and tumor bearing mice

***與正常組比較，P<0.001圖2 正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓細胞中MDSCs的含量Fig 2 MDSC ratios from bone marrow of normal and tumor bearing mice

*與正常組比較，P<0.05圖3 正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中MCT mRNA的表達水平Fig 3 MCT mRNA levels in MDSCs from bone marrow of normal and tumor bearing mice

**與正常組比較，P<0.01圖4 正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓MDSCs中LDHB mRNA的表達水平Fig 4 LDHB mRNA levels in MDSCs from bone marrow of normal and tumor bearing mice

能量代謝涉及細胞生命活動的各個方面，深入了解MDSCs的能量代謝特點有助于揭示其如何發(fā)揮免疫抑制功能，但國內外鮮有相關研究。腫瘤細胞的快速增殖消耗了大量的葡萄糖，能源物質相對匱乏的腫瘤微環(huán)境對浸潤其中的各種細胞是不利的；同時，也導致局部微環(huán)境大量乳酸堆積，這將不利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

前期，課題組成員的研究結果表明[12]：鼻咽癌病人外周血中的MDSC數(shù)量顯著高于正常人，且其能量代謝的重要分子MCT1也顯著高于正常人。但是該研究的缺陷在于：正常人和鼻咽癌病人的身體狀況較為復雜，這必定造成較大的異質性，且正常人血液MDSCs的比例相對較低，這都不利于我們后續(xù)探索性實驗的開展。因此，在前期工作的基礎上，進一步在動物模型上進行探討。本研究結果表明：荷乳腺癌小鼠MDSCs 比例顯著高于正常小鼠，同時其MCT1的表達顯著高于正常小鼠，這與前期[12]在鼻咽癌病人外周血中得到的結果相似?？梢酝茰y：正是由于MDSCs高表達MCT1，可將大量的乳酸轉運至胞內，腫瘤局部微環(huán)境中大量堆積的乳酸反而成了MDSCs重要的能源物質， MDSCs細胞表面的MCT1分子可能是乳酸的關鍵“清道夫”[13-14]。當然，乳酸被攝入后在胞內不斷堆積也不利于MDSCs各項生物學功能的發(fā)揮，我們的研究表明：荷乳腺癌小鼠MDSCs的LDHB表達顯著高于正常小鼠，這將很好的緩解了胞內的乳酸堆積，LDHB可將胞內的乳酸轉變成丙酮酸，最終進入三羧酸循環(huán)進而被徹底氧化分解，提供各項生命活動所需的ATP。在局部腫瘤微環(huán)境中能源物質缺乏的情況下，MDSCs或許就是憑借高表達MCT1攝入大量堆積的乳酸，并由LDHB將后者進一步轉變成丙酮酸后最終徹底氧化分解。正因如此，與正常小鼠相比，荷乳腺癌小鼠MDSCs不僅在數(shù)量上占據巨大優(yōu)勢，其代謝特點使其能夠利用乳酸作為能源物質更好地發(fā)揮免疫抑制作用，而腫瘤微環(huán)境乳酸的降低也將促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些結果提示：從能量代謝的角度靶向消除或抑制MDSCs的免疫抑制功能將是一個不錯的思路。

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ExpressionandsignificanceofMCT1andLDHBinMDSCsfrombonemarrowofbreastcancerbearingmice

LAN Ruilong1,2, ZHANG Na3, CHEN Ruiqing1,2

(1.CentralLaboratoryoftheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China; 2.FujianKeyLaboratoryofIndividualizedActiveImmunotherapy,Fuzhou350005,China; 3.FujianInsituteofHematology,FujianProvincialKeyLaboratoryonHematology,FujianMedicalUniversityUnionHospital,Fuzhou350001,China)

ObjectiveTo test the MDSCs ratios in bone marrow from normal and breast cancer bearing mice, and compare the mRNA levels of the key energy metabolism molecules-MCT1/LDHB and explore the possible mechanism of immunosuppression in MDSCs.MethodsMDSCs (CD11b+Gr-1+) in bone marrow was sorted by BD FACSAriaⅢ. MCT1/LDHB mRNA levels were detected with q-PCR.ResultsThe MDSCs ratio (19.77±4.77)% in breast cancer bearing mice was much higher than that (0.84±0.18)% in normal group (P<0.001).Both MCT1 and LDHB mRNA of MDSCs in tumor bearing group were significantly higher than that in normal group (P<0.05 andP<0.01, respectively).ConclusionsThe energy metabolism could play an role in the immunosuppression of MDSCs.

MDSC; MCT1; LDHB; energy metabolism; immunosuppression

福建省衛(wèi)計委青年課題(2016-1-60)；2016年福建醫(yī)科大學啟航基金(2016QH042)

藍瑞隆(1986-)，男，研究實習員。E-mail：lanruilong123@126.com

陳瑞慶，助理研究員。E-mail: crq209ted@163.com

10.11724/jdmu.2017.06.03

R73

A

1671-7295(2017)06-0532-04

藍瑞隆，張娜，陳瑞慶.MCT1和LDHB在荷乳腺癌小鼠髓系抑制性細胞中的表達及意義[J].大連醫(yī)科大學學報，2017,39(6)：532-535.

2017-09-01；

2017-11-02)