孟盼 黃會珍 楊琴 趙洪慶 楊蕙 韓遠山 凌佳 王宇紅

摘要：目的 觀察逍遙抗癌解郁方對乳腺癌并發(fā)抑郁癥模型小鼠的影響，探討其作用機制。方法 以BALB/c雌性小鼠為研究對象，采用腋下注射4T1炎性乳腺癌細胞聯(lián)合腹腔注射皮質酮（CORT）建立乳腺癌并發(fā)抑郁癥模型小鼠。根據(jù)糖水消耗量隨機分為空白組、模型組、紫杉醇組、逍遙抗癌解郁方組、化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組，分別給予相應藥物21 d后，采用糖水偏好實驗、Open-field實驗和新奇攝食實驗檢測小鼠行為學變化；ELISA檢測小鼠血漿促腎上腺激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質激素（ACTH）、CORT，血清5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE），腫瘤標志物糖類抗原CA153、CA125和癌胚抗原（CEA）的含量。結果 與空白組比較，模型組小鼠糖水偏好度、水平與垂直運動明顯降低（P<0.01，P<0.05），攝食潛伏期明顯增加（P<0.01，P<0.05），腫瘤標志物CA153、CA125和CEA含量及下丘腦-垂體-腎上腺軸相關指標顯著升高（P<0.01）；單胺神經(jīng)遞質NE、DA和5-HT明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，化療+逍遙抗癌解郁方組小鼠糖水消耗量顯著升高，自主行為活動增加，行為絕望狀態(tài)改善（P<0.01，P<0.05）；腫瘤標物及HPA軸相關指標含量明顯降低（P<0.01，P<0.05）；5-HT、DA和NE含量明顯升高（P<0.01，P<0.05）。結論 逍遙抗癌解郁方聯(lián)合紫杉醇可有效緩解乳腺癌并發(fā)抑郁癥的抑郁樣指征。

關鍵詞：逍遙抗癌解郁方；乳腺癌并發(fā)抑郁癥；單胺神經(jīng)遞質；下丘腦-垂體-腎上腺軸；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0046-06

Abstract： Objective To investigate the effects of Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula on mice with breast cancer related depression； To explore its mechanism. Methods BALB/c female mice were set as study objects. Subaxillary injection of inflammatory 4T1 cells and intraperitoneal injection of corticosterone were used to establish a model of breast cancer related depression. According to the consumption of sugar water， mice were randomly divided into blank group， model group， paclitaxel group， Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula group， chemotherapy + fluoxetine group， and chemotherapy + Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula group. After 21 days， sucrose preference test， open-field test， and novelty feeding test were performed to detect changes in the behavior of mice in each group. ELISA were used to detected the contents of corticotrophin releasing hormone （CRH）， adrenocorticotropic hormone （ACTH）， and corticosterone （CORT） in plasma， and the contents of 5-hydroxytryptamine （5-HT）， dopamine （DA）， norepinephrine（NE）， tumor markers carbohydrate antigen CA153， CA125 and carcinoembryonic antigen （CEA） in serum. Results Compared with the blank group， the consumption of sugar， horizontal and vertical movements of mice in the model group significantly decreased （P<0.01， P<0.05）； the latency of ingestion significantly increased （P<0.01， P<0.05）； the levels of tumor markers CA153， CA125， CEA and some indexes of HPA axis significantly increased （P<0.01）； the expressions of monoamine neurotransmitter NE， DA and 5-HT significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， sugar consumption and autonomic activity significantly increased in the chemotherapy + Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula group， and behavioral despair condition was improved （P<0.01， P<0.05）； the content of tumor markers and some indexes related to HPA axis significantly decreased （P<0.01， P<0.05）； the contents of 5-HT， DA and NE significantly increased （P<0.01， P<0.05）. Conclusion The combination of Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula and paclitaxel can effectively relieve the depressive symptoms of breast cancer related depression.

Keywords： Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula； breast cancer related depression； monoamine neurotransmitters； HPA axis； mice

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，居我國女性惡性腫瘤之首。抑郁癥作為惡性腫瘤常見的并發(fā)情感障礙類疾病，伴發(fā)幾率較高，抑郁患者又會因不良情緒對疾病產(chǎn)生恐懼和擔憂，在一定程度上加重乳腺癌病情，嚴重影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和轉歸。目前，臨床上治療乳腺癌并發(fā)抑郁癥（breast cancer related with depression，BCRD）方法主要是在疾病確診后分別進行抗腫瘤和抗抑郁治療，起效慢，易引起惡心、嘔吐、頭暈頭痛等不適癥狀，治療效果具有一定的局限性，且由于抑郁患者的心理原因會降低患者對藥物的依從性，加大治療難度。中醫(yī)藥立足整體，通過多環(huán)節(jié)、多途徑調節(jié)，能較好改善患者的臨床癥狀。本實驗采用具有“疏肝解郁、健脾補腎、化瘀解毒”功效的逍遙抗癌解郁方（逍遙散加減）加以干預，觀察逍遙抗癌解郁方對BCRD小鼠抑郁樣指征的影響，探討其相關機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級BALB/c雌性小鼠，4～6周齡，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于光暗周期為12 h/12 h、溫度30 ℃、濕度50%的SPF級環(huán)境，適應性喂養(yǎng)5 d，自由攝食飲水。

1.2 藥物

逍遙抗癌解郁方（柴胡9 g、當歸9 g、姜黃9 g、貫葉連翹3 g、枸杞子9 g、菟絲子9 g、夏枯草15 g、重樓9 g、人參6 g、白花蛇舌草15 g等），飲片購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)水煎濃縮成0.975 g原藥材/mL；鹽酸氟西汀片，湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，法國patheon，批號J20130010。注射用紫杉醇脂質體，規(guī)格30 mg/支，深圳萬樂制藥有限公司，批號201707。

1.3 主要試劑與儀器

皮質酮（CORT，索萊寶生物公司），RPMI培養(yǎng)基（HyClone），胰酶（HyClone），胎牛血清（四季青），DAB顯色試劑盒（中杉金橋），雙抗（HyClone），PBS（中杉金橋），DMSO（上海藍潤化學有限公司），二甲苯、蘇木素、多聚甲醛（上海匯虹試劑有限公司），促腎上腺皮質激素（ACTH）、促腎上腺激素釋放激素（CRH，R&D;公司）。多功能酶標儀（Thermo公司），光學顯微鏡（ZEISS）。

2 實驗方法

2.1 4T1炎性乳腺癌細胞培養(yǎng)

4T1炎性乳腺癌原代細胞株（武漢普諾賽生物公司），顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，0.22 μm過濾器過濾細胞，棄掉培養(yǎng)液，離心，加入RPMI培養(yǎng)液（內含10%胎牛血清、1%雙抗）10 mL，移至25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2～4 d后，觀察細胞生長狀態(tài)，若長至80%～90%，棄去培養(yǎng)液，PBS洗1次，加入胰酶消化，2 min后用移液槍輕輕吹打細胞，使80%～90%細胞消化，加入胰酶體積的含血清培養(yǎng)基終止消化，將細胞轉移至5 mL離心管中，4 ℃、1500 r/min離心8 min，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，并將細胞濃度調整為107個/mL。

2.2 乳腺癌并發(fā)抑郁動物模型制備

參考文獻[1-2]方法。以Balb/c小鼠為對象，在其腋下接種107個/mL 4T1炎性乳腺癌細胞0.1 mL，接種7 d后，觀察其是否成瘤，小鼠成瘤即表示乳腺癌模型成功復制。在小鼠腋下成瘤后，背部皮下注射CORT混懸液（每300 mg CORT用5 mL DMSO預溶解，超聲將CORT在DMSO中充分溶解，加95 mL生理鹽水）30 mg/kg，連續(xù)注射21 d，隨后用行為學指標檢測抑郁癥模型是否建立成功，用以復制乳腺癌并發(fā)抑郁癥模型小鼠。

2.3 分組

小鼠適應性喂養(yǎng)5 d，按糖水消耗量隨機分為空白組、模型組、紫杉醇組、逍遙抗癌解郁方組、化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組，每組10只。

2.4 給藥

化療各組予注射用紫杉醇脂質體（制成1 mg/mL混合液）腹腔注射，每周1次，給藥體積為20 mL/kg；氟西?。ㄖ瞥?.13 mg/mL的混懸液，4 ℃低溫保存?zhèn)溆茫┙o藥體積為19.5 mL/kg；逍遙抗癌解郁方給藥體積為20 mL/kg；空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)3周。所有藥物給藥劑量均按人體質量等效劑量計算。

2.5 指標檢測

2.5.1 行為學檢測

2.5.1.1 糖水偏好實驗

糖水偏好度反應抑郁動物快感缺失癥狀。將小鼠飼養(yǎng)于單籠內，禁食禁水12 h后，給予事先稱好質量1%蔗糖水和蒸餾水各1瓶，1 h后取出水瓶，稱量剩余的蔗糖水與蒸餾水的質量。糖水消耗總共測量4次，時間分別為抑郁造模前和造模后1、2、3周。糖水偏好度（%）=糖水消耗量÷（蒸餾水消耗量+糖水消耗量）×100%。

2.5.1.2 Open-field實驗

小鼠禁食不禁水24 h，將動物放入箱中心，實驗箱規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm。適應30 s后，觀察并記錄動物在3 min內雙后肢跨越方格的個數(shù)（水平運動）與前肢騰空或攀爬墻壁的次數(shù)（垂直運動）。實驗在無明顯光源的環(huán)境中進行，觀察完畢擦拭箱內壁及底面，以免動物余留信息影響下次測試結果。

2.5.1.3 新奇攝食實驗

小鼠禁食不禁水24 h，將動物面向箱壁從同一位置放入試驗箱，實驗箱規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm，箱中心放入適量等體積食物，適應30 s后，觀察并記錄小鼠5 min內首次咀嚼食物的時間。實驗在無明顯光源的環(huán)境中進行，觀察完畢擦拭箱內壁及底面，以免動物余留信息影響下次測試結果。

2.5.2 血液學指標檢測

行為學檢測完成后，小鼠禁食禁水24 h，摘眼球取血。左手捏住小鼠耳后皮毛，使眼球突出，右手持鑷子將眼球迅速摘除，用含或不含肝素鈉的EP管接住從眼眶中滴出的血液。4 ℃靜置2 h，3000 r/min離心10 min，取上清液，置于液氮中速凍，后轉移至超低溫保存箱備用。將保存?zhèn)溆玫难寤蜓獫{樣本室溫下解凍，嚴格按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中單胺類神經(jīng)遞質5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）的含量，血漿中CORT、CRH、ACTH及腫瘤標志物糖類抗原CA153、CA125和癌胚抗原（CEA）的含量。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以x±s表示，組間差異比較采用方差分析，兩兩比較方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett's T3進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

4 結果

4.1 行為學變化

4.1.1 逍遙抗癌解郁方對模型小鼠糖水偏好度的影響

與空白組比較，造模前和造模第1周模型小鼠糖水偏好度比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），造模第2、3周模型組糖水偏好度明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），且隨造模時間延長，糖水偏好度下降更明顯；與模型組比較，造模第2周化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組糖水偏好度明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。造模第3周化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組、逍遙抗癌解郁方組糖水偏好度明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），尤以化療+聯(lián)合逍遙抗癌解郁方組效果最明顯。結果見表1。

4.1.2 逍遙抗癌解郁方對模型小鼠自主行為的影響

與空白組比較，模型組小鼠水平運動、垂直運動次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組水平運動、垂直運動次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），化療組、逍遙抗癌解郁方組對小鼠自主活動有一定的影響，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表2。

4.1.3 逍遙抗癌解郁方對模型小鼠新奇攝食潛伏期的影響

與空白組比較，模型組小鼠攝食潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組小鼠攝食潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），化療組、逍遙抗癌解郁方組可縮短小鼠攝食潛伏期，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表3。

4.2 逍遙抗癌解郁方對模型小鼠血漿腫瘤標志物含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿腫瘤標志物CA153、CA125和CEA明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，化療組、化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組小鼠血漿腫瘤標志物CA153、CA125和CEA明顯下降（P<0.01，P<0.05）。結果見表4。

4.3 逍遙抗癌解郁方對模型小鼠血清單胺類神經(jīng)遞質含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清單胺類神經(jīng)遞NE、DA和5-HT均明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組小鼠血清單胺類神經(jīng)遞質NE、DA和5-HT均明顯上升（P<0.01，P<0.05）。結果見表5。

4.4 逍遙抗癌解郁方對模型小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸相關指標的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿CORT、ACTH、CRH均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.01）；與模型組比較，逍遙抗癌解郁方組、化療+氟西汀組、化療+逍遙抗癌解郁方組小鼠血漿CORT、ACTH和CRH均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）。結果見表6。

5 討論

心理狀況影響乳腺患者的生活質量，也預示著患者預后的好壞。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中63.5%伴發(fā)抑郁癥，其中17.3%為重度抑郁[3]。

血清腫瘤標志物檢測具有簡便、快捷等優(yōu)勢，對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后具有重要的臨床意義。血清CEA、CA153、CA125是乳腺癌臨床診斷應用廣泛的一類腫瘤標志物[4]。本實驗結果表明，逍遙抗癌解郁方可較好輔助化療藥的功效，即降低BCRD小鼠腫瘤標志物CA153、CA125和CEA的表達。

抑郁模型動物行為學評價在某種程度可重現(xiàn)抑郁患者行為學的特征。自主探究活動下降及緊張度增高是抑郁癥的重要表征，新奇攝食實驗潛伏期是觀察研究實驗動物神經(jīng)精神變化，評價實驗動物在新奇環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一個重要參數(shù)；快感缺失是抑郁癥的核心癥狀，在動物研究方面主要是以糖水偏好的程度作為參考指標。本實驗研究結果表明，BCRD小鼠存在快感缺乏癥狀等典型的抑郁樣癥狀，而化療藥物聯(lián)合逍遙抗癌解郁方可提高BCRD小鼠對快感的反應度，增加模型小鼠新奇環(huán)境中的自主行為、探索與攝食欲望，逆轉BCRD小鼠抑郁樣精神狀態(tài)。

“單胺假說”是目前公認的抑郁癥發(fā)病的病理基礎，該假說認為抑郁癥的發(fā)病與中樞神經(jīng)單胺類神經(jīng)遞質5-HT、NE、DA的耗竭緊密相關[5]。研究表明，5-HT、NE、DA耗竭劑能使抑郁癥狀加劇，而其降低程度與抑郁癥的嚴重程度呈正相關[6]。因而，增加大腦單胺類神經(jīng)遞質水平是治療抑郁癥的重要途徑之一。目前臨床上主要以5-HT、NE重吸收抑制劑作為抑郁癥治療的首選藥物，此類藥物可通過阻斷5-HT或NE重吸收，提升其在突觸間隙的濃度，進而有效緩解病情[7]。本研究結果表明，化療聯(lián)合逍遙抗癌解郁方可顯著升高BCRD小鼠血液中單胺類神經(jīng)遞質NE、DA和5-HT的表達，可能以此達到其抗抑郁的功效。

抑郁癥屬應激性疾病，其發(fā)生與下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的亢進密切相關[8]，HPA軸作為大腦應激應答的重要機制之一，在抑郁癥的病因、病理學機制中起關鍵作用。當HPA軸長期處于亢進狀態(tài)，可導致神經(jīng)內分泌異常和抑郁樣行為的發(fā)生[9]。心理應激主要通過以HPA軸為中心的網(wǎng)絡來影響大腦某些區(qū)域，如藍斑、海馬等，故而乳腺癌并發(fā)抑郁癥作為一種復雜的慢性心理應激狀態(tài)，必然與HPA軸緊密相關[10]。急、慢性應激事件可促使下丘腦分泌 CRH，CRH刺激腦垂體分泌ACTH，ACTH刺激腎上腺皮質釋放CORT。CORT是HPA軸重要激素之一，可調節(jié)人體的代謝、認知功能和情緒等，尤其對恐懼和焦慮情緒作用明顯[11]。本研究結果表明，逍遙抗癌解郁方可明顯地降低BCRD小鼠血漿CORT、ACTH和CRH的表達，化療藥物聯(lián)合逍遙抗癌解郁方可逆轉HPA軸的功能亢進。

逍遙抗癌解郁方由《太平惠民和劑局方》之逍遙散加減而成，方用枸杞子、菟絲子補腎益精，夏枯草、重樓化瘀解毒，姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經(jīng)之血瘀氣結，主血瘀氣滯諸證，貫葉連翹疏肝解郁，人參安神益智。本研究結果表明，逍遙抗癌解郁方與化療藥物聯(lián)用可明顯緩解乳腺癌并發(fā)抑郁癥的抑郁樣癥狀，并能有效輔助化療藥物延緩乳腺癌并發(fā)抑郁癥的發(fā)展。

參考文獻：

[1] YAN L， LI L， HAO F， et al. Establishment of mice breast cancer model in BALB/c mice with 4T1 cells[J]. Chinese Journal of Immunology，2014，30（6）：794-796.

[2] GUPTA D， RADHAKRISHNAN M， KURHE Y. Effect of a novel 5-HT3 receptor antagonist 4i， in corticosterone-induced depression- like behavior and oxidative stress in mice[J]. Steroids，2015， 96（11）：95-102.

[3] PARK E M， GELBER S， ROSENBERG S M， et al. Anxiety and depression in young women with metastatic breast cancer：a cross-sectional study[J]. Psychosomatics，2018，59（3）：251-258.

[4] 皮亞平，田柳.腫瘤標志物CA153、CA125聯(lián)合檢查對乳腺癌診斷的價值分析[J].實用癌癥雜志，2017，32（8）：1351-1353.

[5] HAMANER M B，DIAMOND B I. Plasma dopamine and norepinephine correlation with psychomotor retardation， anxiety， and depression in nonpsychotic depressed patients：a pilot study[J]. Psychiatry Res，1996，64：209.

[6] HARMER C J， DUMAN R S， COWEN P J. How do antidepressants work？ New perspectives for refining future treatment approaches[J]. Lancet Psychiatry，2017，4（5）：409-418.

[7] FINBERG J P. Update on the pharmacology of selective inhibitors of MAO-A and MAO-B：focus on modulation of CNS monoamine neurotransmitter release[J]. Pharmacol Ther，2014，143（2）：133-152.

[8] KANG H J， BAE K Y， KIM S W， et al. Longitudinal associations between glucocorticoid receptor methylation and late-life depression[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2018， 84（Pt A）：56-62.

[9] BLOCK T S， KUHNER H， KALIN N， et al. Combined analysis of mifepristone for psychotic depression：llasma levels associated with clinical response[J]. Biol Psychiatry，2018，84（1）：30035- 30040.

[10] PARIANTE C M，LIGHTMAN S L. The HPA axis in major depression ：classical theories and new developments[J]. Trends Neurosci， 2008，31（9）：464-484.

[11] WEGER M， SANDI C. High anxiety trait：A vulnerable phenotype for stress induced depression[J]. Neurosci Biobehav Rev，2018，87：27-37.