盧璐 袁建業(yè) 費曉燕 卞慧 林江

摘要：目的 觀察健脾清腸方聯(lián)合骨化三醇對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜白細胞介素-17（IL-17）和干擾素-γ（IFN-γ）表達的影響，探討其作用機制。方法 實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、美沙拉嗪組、骨化三醇組、健脾清腸方+骨化三醇組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠予三硝基苯磺酸灌腸造模。造模后第3日大鼠開始給藥，開始給藥后第11日稱重后處死。期間計算疾病活動指數(shù)（DAI），光鏡下按結(jié)腸組織病理學評分（HPS）評估大鼠結(jié)腸黏膜損傷程度。采用RT-PCR和免疫組化方法檢測結(jié)腸黏膜IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表達。結(jié)果 模型組DAI及HPS明顯高于正常組（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組DAI及HPS顯著降低（P<0.05，P<0.01），美沙拉嗪組和健脾清腸方+骨化三醇組大鼠結(jié)腸黏膜IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表達明顯降低（P<0.01）。結(jié)論 健脾清腸方聯(lián)合骨化三醇可能通過調(diào)節(jié)大鼠輔助T淋巴細胞17細胞，下調(diào)IL-17表達，降低免疫細胞活性，減少炎性細胞分泌，減輕結(jié)腸黏膜的損傷。

關(guān)鍵詞：健脾清腸方；骨化三醇；潰瘍性結(jié)腸炎；干擾素-γ；白細胞介素-17；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.009

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0036-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Jianpi Qingchang Decoction combined with Calcitriol on the expressions of IL-17 and IFN-γ in colitis in rats with ulcerative colitis； To discuss the mechanism of action. Methods Experimental rats were randomly divided into control group， model group， Mesalazine group， Calcitriol group， Jianpi Qingchang Decoction + Calcitriol group， with 10 rats in each group. Except for the control group， other groups were given TNBs for modeling. The administration began on the 3rd day after modeling. All rats were weighed and sacrificed on the 11th day after administration. The disease activity index （DAI） were calculated and the colon histopathological （HPS） were evaluated under microscope. The mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17 in colonic mucosa were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the control group， the DAI and HPS of the model group increased significantly （P<0.01）； Compared with the model group， the DAI and HPS of administration groups were reduced significantly （P<0.05， P<0.01）， and the mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17 in Mesalazine group and Jianpi Qingchang Decoction + Calcitriol group decreased significantly （P<0.01）. Conclusion Jianpi Qingchang Decoction combined with Calcitriol can down-regulate IL-17 expression， decrease the activity of immune cells， reduce the secretion of inflammatory cells， and lessen the damage of colonic mucosa by regulating Th17 cells.

Keywords： Jianpi Qingchang Decoction； Calcitriol； ulcerative colitis； IFN-γ； IL-17； rats

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是指局限于結(jié)腸黏膜層的非特異性潰瘍性病變。臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液血便、發(fā)熱、貧血等，可并發(fā)中毒性腸擴張、腸出血、腸穿孔。研究顯示，UC患者普遍存在維生素D缺乏[1-2]。體外實驗表明，VitD缺乏的CD4+T細胞過量產(chǎn)生白細胞介素-17（IL-17）和干擾素-γ（IFN-γ），而活性VitD3可抑制輔助T淋巴細胞17（Th17）細胞，從而改善Th17細胞所介導的炎癥反應[3]。本課題組針對UC脾氣虧虛、濕毒蘊結(jié)的病機關(guān)鍵，自擬健脾清腸方用于臨床，療效較好。本實驗觀察健脾清腸方聯(lián)合骨化三醇對三硝基苯磺酸（TNBs）誘導UC大鼠IL-17、IFN-γ的影響，從細胞層面探討中藥及維生素D對UC的免疫調(diào)節(jié)機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。飼養(yǎng)于晝夜光線變化、恒濕、恒溫環(huán)境，自由攝食飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物

健脾清腸方顆粒（黨參15 g，黃芪30 g，黃連6 g，馬齒莧30 g，地榆15 g，白及3 g，三七6 g，木香9 g，甘草6 g），上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。美沙拉嗪腸溶片，0.25 g/粒，葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號111206；骨化三醇膠丸，0.25 μg/粒，瑞士上海羅氏制藥有限公司，批號H20150127。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥（上海西唐生物），TNBs原液（德國Sigma），兔抗IFN-γ、兔抗IL-17及即用型SABC免疫組化染色試劑盒（北京博奧森生物），F(xiàn)Q-PCR試劑盒（上海達為科生物）。顯微鏡（日本OLYMPUS），PCR儀（加拿大Funglyn Biotech），Powerlab數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（澳大利亞ADInstruments）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

50只大鼠隨機分為正常組、模型組、美沙拉嗪組、骨化三醇組和健脾清腸方+骨化三醇組，每組10只。除正常組外，其余4組大鼠均予戊巴比妥鈉麻醉后予TNBs灌腸法造模[4]。造模后每日觀察并記錄大鼠大便數(shù)量、性狀及體質(zhì)量、精神活動等。

2.2 給藥

大鼠造模后第3日，除模型組外，其余各組大鼠給予1.0 mL/200 g體質(zhì)量灌胃，每日1次，連續(xù)10 d。正常組予蒸餾水灌胃；骨化三醇組用無菌大豆油將骨化三醇膠丸中液體稀釋，配制成濃度為1 μg/mL混懸液灌胃[5-6]；健脾清腸方+骨化三醇組將健脾清腸顆粒劑加蒸餾水配制成196.9 mg/mL溶液與1 μg/mL骨化三醇混懸液充分混合后灌胃；美沙拉嗪組將美沙拉嗪腸溶片研磨成細粉，加入蒸餾水配制成112 mg/mL混懸液灌胃。藥物用量按照人和動物間體表面積折算等效劑量比值表[7]計算。

2.3 標本采集

各組大鼠給藥后第11日稱重并處死，迅速剖取自肛門往上至8 cm的結(jié)腸，生理鹽水沖洗干凈，將結(jié)腸黏膜層向上置于白色卡紙上，肉眼觀察結(jié)腸黏膜急性損傷程度。隨后挑取黏膜破損最為顯著處病變腸段，沿縱軸切開，分為2部分，一部分于10%甲醛中固定，剩余標本裝入Eppendorf管后，-80 ℃冰箱保存，分別行病理、免疫組化及RT-PCR檢測。

2.4 大鼠疾病活動指數(shù)及結(jié)腸組織病理學評分

造模后每日大鼠稱重，觀察大鼠活動及大便數(shù)量和性狀，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）[8]。常規(guī)HE染色后，光鏡下按結(jié)腸組織病理學評分（histopathological score，HPS）評估UC大鼠結(jié)腸黏膜損傷程度[9]。

2.5 免疫組化檢測結(jié)腸黏膜白細胞介素-17和干擾素-γ蛋白表達

結(jié)腸組織經(jīng)切片、烤片、脫蠟、水化及熱抗原修復后，滴加IFN-γ、IL-17一抗（工作濃度均為1∶100）， 4 ℃過夜，PBS洗2 min×3次。滴加二抗37 ℃ 20 min；PBS洗2 min×4次。滴加3抗后置恒溫箱37 ℃ 20 min。PBS洗5 min×4次，標本置于PBS。加入DAB顯色液（先抽吸1 mL蒸餾水，再加入DAB顯色液各1滴），加20 ?L至標本上完全覆蓋，顯色5 min后，用蒸餾水沖洗，復染后乙醇由低至高濃度逐級脫水，加入二甲苯后封片，鏡檢。每張切片隨機選定3個視野（×200），運用醫(yī)學圖像定量分析系統(tǒng)對免疫組化圖像中陽性區(qū)域面積及光密度（OD）值進行測定，計算免疫組化指數(shù)（IHC）。IHC=陽性面積×OD值÷總面積。

2.6 RT-PCR檢測結(jié)腸黏膜白細胞介素-17和干擾素-γ基因表達

取結(jié)腸組織提取總RNA，移至5 mL玻璃試管中，每一試管加入1 mL預冷Trizol，勻漿。每個標本處理后棉球擦拭，DEPC處理水清洗；依次將勻漿液轉(zhuǎn)至1.5 mL Eppendorf管。各管中加200 μL氯仿，振蕩搖勻15 s；4℃、12 000 r/min離心15 min；吸出水層加至Eppendorf管，再加二倍體積異丙醇（約600 μL），混勻，置于-20 ℃冰箱30 min；4 ℃、10 000 r/min離心15 min。棄上清液留沉淀；用650 μL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、8000 r/min離心5 min，棄上清液留沉淀；打開管蓋，65 ℃干式恒溫器烘干5～10 min。20 μL DEPC處理水，溶解RNA，-20 ℃冰箱保存待用。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，將制備好cDNA進行PCR擴增，并運用Prism7500軟件（上海生工）設(shè)計并合成引物，最后采用相對定量，比較管家基因（GAPDH）與目的基因的Ct值，得出所測標本目的基因相對表達量。相對mRNA表達=2-ΔCt×100%，ΔCt值=Ct值靶基因-Ct值GAPDH。

3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism5.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用Student's t檢驗，多組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

造模后第1日大鼠大便次數(shù)逐漸增多，糞質(zhì)稀軟；造模后第3日癥狀達到高峰，90%大鼠出現(xiàn)黏液膿血便，并且嗜臥扎堆、毛色無華；給藥第10日模型組大鼠仍有黏液血便而健脾清腸方+骨化三醇組大鼠糞便尚不成形，但黏液膿血基本消失；美沙拉嗪組大鼠無黏液膿血便且大便多數(shù)成形，偶見軟便。

4.2 疾病活動指數(shù)和病理學評分比較