溫福利, 梁 成, 莊躍宏, 馬 雷, 鄭和平

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院)比較醫(yī)學(xué)科, 福州 350025;2. 福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系, 福州 350108)

幾種炎癥因子在小鼠跨區(qū)供血耳瓣choke區(qū)血管新生過程中的作用

溫福利1, 梁 成1, 莊躍宏2, 馬 雷1, 鄭和平1

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院)比較醫(yī)學(xué)科, 福州 350025;2. 福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系, 福州 350108)

目的探討幾種炎癥因子在choke區(qū)血管新生過程中的作用。方法建立小鼠跨區(qū)供血耳瓣模型，切取小鼠耳瓣，HE染色后，觀察血管管徑變化。運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，分別在造模術(shù)后當(dāng)日(0 d)、1 d、3 d、5 d、7 d檢測細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(CD68)的表達(dá)情況。結(jié)果對小鼠耳瓣血管管徑觀察顯示，術(shù)后3 d可見新生血管, 7 d后血管擴(kuò)張明顯。在術(shù)后3 d, 兩個(gè)choke區(qū)中CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞聚集量最大，MCP-1和ICAM-1在術(shù)后早期炎癥反應(yīng)期間出現(xiàn)高表達(dá)。choke區(qū)血管擴(kuò)張期間，組織中的三種炎癥因子表達(dá)明顯增多。結(jié)論ICAM-1、CD68、MCP-1三種炎癥因子在血管重塑中起重要作用，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對皮瓣存活起到積極作用。

免疫組織化學(xué); 炎癥因子; choke區(qū); 血管

隨著顯微外科技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟, 跨區(qū)供血皮瓣在臨床中得到廣泛應(yīng)用[1]?？鐓^(qū)供血能力對皮瓣存活至關(guān)重要, choke區(qū)血管的交通吻合是保障血供的組織基礎(chǔ)[2], 而炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是影響choke區(qū)血管新生和血管重塑的重要因素[3]。本實(shí)驗(yàn)通過建立的小鼠跨區(qū)供血耳瓣模型, 對choke區(qū)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)(又稱CD54)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(cluster of differentiation 68, CD68)三種炎癥因子的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，初步探討三種炎癥因子在choke區(qū)血管新生中的作用，為提高臨床跨區(qū)皮瓣的存活提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性KM小鼠36只，體質(zhì)量20～25 g，鼠耳完整無皮膚病變或外傷，均購于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(閩)2016-0002]; 飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科屏障環(huán)境[SYXK(閩)2013-0004], 環(huán)境溫度(22±1) ℃, 相對濕度40%～65%。

1.2 模型建立

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將小鼠麻醉成功后, 用棉簽刮取脫毛膏對鼠耳進(jìn)行脫毛, 觀察鼠耳的血管分布情況，用眼科剪從鼠耳尾側(cè)向頭側(cè)剪斷小鼠耳基底部尾側(cè)2/3，保留頭側(cè)1/3, 形成以耳前動靜脈為蒂內(nèi)含3個(gè)血管體和2個(gè)choke區(qū)的跨區(qū)供血耳瓣[12,13]。小鼠右耳為模型組, 按上述方法建立耳瓣模型。左耳為對照組, 僅作脫毛處理。

1.3 病理學(xué)檢測

術(shù)后3 d、7 d分別切取小鼠耳瓣，置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定24 h，進(jìn)行常規(guī)脫水包埋和切片，HE染色，封片。用PS標(biāo)尺工具測量模型組與對照組血管徑變化。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測

在術(shù)后當(dāng)日(0 d)、1 d、3 d、5 d、7 d分別切取小鼠耳瓣，置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定24 h，垂直于耳基部線切取chokeⅠ區(qū)和chokeⅡ區(qū)組織, 進(jìn)行常規(guī)脫水和石蠟包埋, 切片置于65 ℃烤箱過夜后，采用直接煮沸修復(fù)法進(jìn)行檸檬酸鹽抗原修復(fù)，封閉后滴加美國Abcam公司的兔源一抗ICAM-1(ab124760)、CD68(ab125212)、MCP-1(ab25124), 以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照，二抗按照兔超敏二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明滴加，DAB顯色，封片。在20×物鏡下，隨機(jī)選取不同時(shí)間點(diǎn)chokeⅠ區(qū)和chokeⅡ區(qū)的10根血管, 運(yùn)用Image-pro Plus 6.0可對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量分析, 計(jì)算血管及血管旁50 μm內(nèi)陽性標(biāo)志物的累積吸光度值(A), 檢測ICAM-1、CD68、MCP-1三種炎癥因子的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0軟件對模型組與對照組的差值進(jìn)行相關(guān)性分析，所有數(shù)據(jù)以x-±s表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管管徑變化

模型組小鼠choke區(qū)血管管徑平均值均大于對照組，模型組血管管徑隨著術(shù)后天數(shù)的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(圖1), 術(shù)后3 d可見新生血管, 術(shù)后7 d血管擴(kuò)張明顯，可見耳瓣基底部形成靜脈回流血管，隨后血管變化趨于穩(wěn)定。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 MCP-1的表達(dá)情況 MCP-1兔源一抗的最佳稀釋度為: 1∶1 500, MCP-1陽性表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，呈棕褐色顆粒(圖2)。模型組chokeⅠ區(qū)MCP-1表達(dá)峰值在術(shù)后1 d, chokeⅡ區(qū)的峰值在術(shù)后3 d, 模型組與對照組比較, 差異顯著(P＜0.01)(表1)。隨后A值逐漸下降, 7 d時(shí)模型組與對照組差異不明顯。

2.2.2 CD68的表達(dá)情況 CD68兔源一抗的最佳稀釋度為: 1∶1 000，CD68陽性表達(dá)主要見于單核細(xì)胞, 呈棕褐色顆粒(圖3)。皮瓣切取后, chokeⅠ區(qū)和chokeⅡ區(qū)CD68表達(dá)水平均在術(shù)后3 d達(dá)到峰值, 模型組與對照組比較差異均顯著(P＜0.01)(表2)。

2.2.3 ICAM-1的表達(dá)情況 ICAM-1兔源一抗的最佳稀釋度為: 1∶900，ICAM-1陽性表達(dá)主要見于血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管壁染色后呈棕黃色(圖4)。術(shù)后5 d, chokeⅠ區(qū) ICAM-1的表達(dá)量最大, chokeⅡ區(qū)在術(shù)后3 d達(dá)到峰值, 模型組與對照組比較差異均顯著(P＜0.01)(表3)。在術(shù)后第7日, 兩個(gè)choke區(qū)模型組ICAM-1的表達(dá)量略大于對照組。

3 討論

圖 1 choke區(qū)血管的管徑變化 (HE×200)

表 1 MCP-1累積A值的測量結(jié)果

圖 2 MCP-1在choke區(qū)血管的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)×200)

圖 3 CD68在choke區(qū)血管的表達(dá)情況 (免疫組織化學(xué)×200)

表 2 CD68的累積A值測量結(jié)果

圖 4 ICAM-1在choke區(qū)血管的表達(dá)情況 (免疫組織化學(xué)×200)

表 3 ICAM-1的累積A值測量結(jié)果

外科皮瓣的缺血性壞死是一種常見的并發(fā)癥,可能導(dǎo)致嚴(yán)重的功能缺陷[4]?？鐓^(qū)皮瓣可劃分為解剖學(xué)供區(qū)、動力學(xué)供區(qū)和潛在供區(qū), 皮瓣是否壞死主要取決于跨區(qū)吻合部位(choke區(qū))的血供能力[5-7]。習(xí)珊珊等[8]對建立的背部跨區(qū)供血皮瓣模型大鼠注射二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)后觀察表明，DMOG可增大choke區(qū)血管管徑, 克服缺血、缺氧的損傷。莊躍宏等[9]研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在choke區(qū)血管擴(kuò)張期間血管重塑過程中比基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)發(fā)揮更大作用。血管重塑是動脈生成過程，而動脈生成需要炎性環(huán)境和眾多的細(xì)胞因子[3,10]。

單核細(xì)胞浸潤是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要特征。MCP-1是早期炎癥的重要因子，主要由單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等合成分泌。在正常生理狀態(tài)下，外周血MCP-1含量較少。機(jī)體發(fā)生病變時(shí)，MCP-1激活并誘導(dǎo)單核細(xì)胞向病變組織聚集[11]。ICAM-1主要聚集于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表面。在正常生理狀態(tài)下，ICAM-1很少表達(dá)。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥時(shí)，ICAM-1可促進(jìn)單核細(xì)胞游離出血管，使其轉(zhuǎn)變成CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞，發(fā)揮組織修復(fù)與重建的作用[12]。ICAM-1可作為單核細(xì)胞參與choke區(qū)血管擴(kuò)張的重要因子。研究表明，MCP-1啟動炎癥聯(lián)級反應(yīng)可促進(jìn)單核細(xì)胞穿過血管壁進(jìn)行補(bǔ)給和遷移[13]，MCP-1細(xì)胞因子可快速增強(qiáng)側(cè)支血管生長[14,15]。ICAM-1已被用做動脈生成相關(guān)聯(lián)的單核細(xì)胞粘附和浸潤的指標(biāo)[16]。

本研究中跨區(qū)供血耳瓣模型建立后，chokeⅠ區(qū)模型組MCP-1的表達(dá)量在建模后1 d就達(dá)到峰值，累積A值增加4倍, 隨后緩慢降低。chokeⅡ區(qū)模型組ICAM-1的表達(dá)量在3 d也達(dá)到峰值，在術(shù)后動脈阻塞3 d，兩個(gè)choke區(qū)CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞聚集量最大，MCP-1和ICAM-1在術(shù)后早期炎癥反應(yīng)期間出現(xiàn)高表達(dá)。通過對小鼠耳瓣的血管管徑變化觀察顯示，術(shù)后3 d可見新生血管，7 d后血管擴(kuò)張明顯[17,18]。MCP-1、ICAM-1、CD68是炎癥反應(yīng)的相關(guān)因子，choke區(qū)血管擴(kuò)張后，組織中的三種炎癥因子表達(dá)明顯增多。本研究結(jié)果提示，炎癥反應(yīng)在血管重塑中起重要作用，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對皮瓣存活起到積極作用。

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The Role of MCP-1, CD68 and ICAM-1 in the Process of Angiogenesis in Choke Area of Mice

WEN Fu-li1, LIANG Cheng1, ZHUANG Yue-hong2, Ma Lei1, ZHENG He-ping1
(1. Department of Comparative Medicine, Fujian Medical University Affiliated Fuzhou General Hospital of Nanjing Command, PLA, Fuzhou 350025, China; 2. Department of human Anatomy and History and Embryo, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China)

ObjectiveTo explore the role of inflammation in angiogenesis in choke area.MethodsThe ear flap model of mice was established and the changes of blood vessel diameter was observed by HE staining. The expressions of intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and cluster of differentiation 68 (CD68 ) were detected by immunohistochemistry on the day after modeling(0 d), 1 d, 3 d, 5 d and 7 d, respectively. Result By observing the vascular diameter of the ear flap in mice, it was found that the vessels were visible at 3 d after operation and the vascular dilatation was obvious at 7 d. CD68-labeled macrophages had the largest accumulation in two choke area at 3 d. High expression of MCP-1 and ICAM-1 was observed in the early stage of postoperative inflammatory response. The expression of the three inflammatory factors in the tissue was increased significantly during the vascular dilation.ConclusionThe three inflammatory factors (ICAM-1, CD68 and MCP-1) play an important role in vascular remodeling. Proper inflammatory response plays a positive role in flap survival.

Immunohistochemistry; Inflammatory factor; Choke area; Vessels

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0428-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.002

2017-10-25

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015J01412)和全軍實(shí)驗(yàn)動物科研課題(SYDW(2016)007)

溫福利(1987-), 男, 技師, 碩士研究生, 研究方向: 比較醫(yī)學(xué)。E-mail: wen_fuli@163.com

鄭和平(1962-), 男, 教授 /主任醫(yī)師, 研究方向: 比較醫(yī)學(xué)。E-mail: zhpfz@163.com