鄔曉勇，時(shí)羽杰，李 杰，羅 倩，王躍華，唐 媛, 孫雁霞

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

煙草反義Mlo基因表達(dá)載體的構(gòu)建

鄔曉勇，時(shí)羽杰，李 杰，羅 倩，王躍華，唐 媛, 孫雁霞

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

獲得煙草反義Mlo基因的植物表達(dá)載體pBI 121-Mlo，為進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，獲得該基因表達(dá)的缺陷型植株打下基礎(chǔ).從煙草葉片中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Mlo基因的cDNA，以此為模板設(shè)計(jì)反義引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出反義Mlo基因，將此反義Mlo基因與T載體連接，測(cè)序正確后再將此反義片段與植物表達(dá)載體pBI 121連接，構(gòu)建煙草反義Mlo基因的植物表達(dá)載體pBI 121-Mlo.經(jīng)Kan選擇篩選出反義重組菌落，堿裂解法小量提取質(zhì)粒后，用XbaI和BamHI雙酶切后再進(jìn)行電泳鑒定.結(jié)果表明，目的基因已與植物表達(dá)載體pBI 121連接成功.成功構(gòu)建了煙草反義Mlo基因表達(dá)載體pBI 121-Mlo.

Mlo基因；pBI 121Mlo；RT-PCR；反義片段；雙酶切

0 引 言

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列復(fù)雜而嚴(yán)密的防御機(jī)制，而使自身免受病原物的侵害，這涉及到一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控，其中，Mlo基因就是植物抗病基因中的重要成員之一[1-2].研究發(fā)現(xiàn)，白粉病是由白粉菌引起的真菌性病害，能侵染多種單子葉植物和雙子葉植物[3-4]，野生型Mlo基因是大麥抗白粉病的負(fù)調(diào)控因子，可賦予大麥對(duì)白粉菌的廣譜抗性[5].

目前，科研人員已經(jīng)對(duì)擬南芥、水稻、玉米和楊樹(shù)中的Mlo基因家族進(jìn)行了深入研究[6]，而對(duì)煙草的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道.對(duì)此，本研究以構(gòu)建煙草Mlo基因反義表達(dá)載體為基礎(chǔ)，鑒定Mlo基因是否是抗白粉病的負(fù)調(diào)控因子，擬對(duì)其在煙草抗病方面的負(fù)調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：紅花大金元品種煙草的無(wú)菌苗葉片；DL2000 DNA Marker、GREENspspin多糖多酚類(lèi)植物RNA快速提取試劑盒、高純度質(zhì)粒提取試劑盒、pBLUE-T載體、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)于北京莊盟生物有限公司，TIANgen midi purification kit試劑盒，購(gòu)自于大連TaKaRa公司；JM109菌株由北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陸海教授惠贈(zèng).

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：5020型基因擴(kuò)增儀(Thermo公司)，PAC300型電泳儀(BIORAD公司)，MDF-382E型超低溫冰箱(SANYO公司)，Eppendorf微量移液器、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，ZF-90型暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)，F(xiàn)A2004型電子天平(上海超平科學(xué)儀器有限公司)，AIRTECH超凈工作臺(tái)(安泰公司).

1.3 方 法

1.3.1 煙草Mlo基因的克隆.

1)煙草總RNA提取.通過(guò)GREENspspin多糖多酚類(lèi)植物RNA快速提取試劑盒提取煙草的總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取情況.

2)NA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.根據(jù)提取到的RNA，用TIANgen midi purification kit試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?

反轉(zhuǎn)錄具體步驟：①在Ep管中依次加入下列溶液，Oligo(dT)18 Primer，1 μ、煙草RNA樣品，10 μL.此操作可在PCR儀中完成，70 ℃后立即置于冰上冰浴2～5 min.②依次加入下列試劑，AMV Reverse Transcriptase 2 μL、5*Reverse Transcriptase Buffer 5 μL、dNTP Mixture(10 mM each) 2 μL、ddH2O 5 μL.

3)cDNA擴(kuò)增成煙草Mlo基因.以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增煙草Mlo基因.

①上游引物(P1)：

CACGGATTAGCTAAAGGTTAGGGC

②下游引物(P2)：

GCTGAATTACTCCCAATCGGCATC

PCR反應(yīng)體系(25 μL)如表1所示.

表1 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件為：首先，94 ℃預(yù)變性5 min；其次，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min，獲得煙草Mlo基因的DNA序列.

4)煙草Mlo基因與T載體連接.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，用小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，回收的Mlo基因與pBLUE-T載體連接后由北京華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定.

1.3.2 煙草Mlo基因反義表達(dá)載體構(gòu)建.

1)PCR獲得Mlo基因的反義片段.在成功克隆到與預(yù)期大小一致的Mlo基因后，通過(guò)反義引物克隆Mlo基因的反義片段，進(jìn)一步構(gòu)建反義表達(dá)載體.設(shè)計(jì)如下2條反義引物，同時(shí)為了將其與植物表達(dá)載體pBI 121連接，設(shè)計(jì)引物時(shí)還引入了帶有保護(hù)堿基的酶切位點(diǎn).

GCTCTAGAGTTAGCAGCAGCTTGTGGACAAC

畫(huà)線部分為Xba I酶切位點(diǎn).

②下游引物：

CGGGATCCTGAGATCTGTGGAATCCATAG

畫(huà)線部分為BamH I酶切位點(diǎn).

PCR反應(yīng)體系(25 μL)如表2所示.

表2 PCR反應(yīng)體系

擴(kuò)增程序?yàn)?首先，94 ℃預(yù)變性5 min；其次，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min，獲得煙草Mlo基因的反義片段后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反義片段是否擴(kuò)增成功.

小竅門(mén)：瘦豬肉用蠔油腌制，因?yàn)橄栍捅柔u油含有更多的鋅。各種新鮮、天然的蔬菜瓜果、不加糖的鮮榨果蔬汁、紅薯、煮玉米、堅(jiān)果類(lèi)。當(dāng)然，那些過(guò)度加工含有太多食品添加劑的零食就屬于限制級(jí)的零食，盡量少給孩子吃或者不吃，這些食物包括：膨化食品、巧克力派、糖果、炸雞塊、炸雞翅、奶油夾心餅干、方便面、奶油蛋糕、水果罐頭、果脯、蜜棗脯、全脂或低脂煉乳、炸薯片和炸薯?xiàng)l、高糖分汽水或可樂(lè)等碳酸飲料、較甜的雪糕、冰激凌等。

2)反義片段測(cè)序.擴(kuò)增出的反義片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，用小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將此片段回收后與pBLUE-T載體連接，命名為pBLUE-Mlo，由北京華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定.

3)反義Mlo基因與pBI 121連接.利用限制性內(nèi)切酶Xba I、BamH I分別對(duì)反義克隆載體pBLUE-Mlo及植物表達(dá)載體pBI l21進(jìn)行37 ℃過(guò)夜雙酶切.酶切反應(yīng)體系(20 μL)如表3、表4所示.

表3 反義pBLUE-Mlo雙酶切體系

表4 pBI 121雙酶切體系

將反義Mlo基因片段定向連接到植物表達(dá)載體pBI 121中，命名為pBI 121Mlo(14 ℃連接至少48 h)，連接體系(10 μL)如表5所示.

表5 反義Mlo與pBI 121連接體系

反義Mlo基因片段與表達(dá)載體pBI 121連接重組載體pBI 121Mlo的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示.

4)大腸桿菌轉(zhuǎn)化與反義表達(dá)載體的鑒定.將pBI 121-Mlo熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌液涂布于含Kan的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)14～16 h.挑取培養(yǎng)基上的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒.

圖1煙草反義表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程

5)經(jīng)Kan選擇篩選出反義重組菌落，利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行電泳后，用BamH I和XBa I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否反義表達(dá)載體pBI 121-Mlo構(gòu)建成功.

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草總RNA提取結(jié)果

通過(guò)GREENspspin多糖多酚類(lèi)植物RNA快速提取試劑盒提取煙草的總RNA,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取情況，電泳圖如圖2所示.

圖2 RNA電泳圖

由圖2可以看出，2個(gè)煙草樣品分別有RNA的28 s與18 s 2個(gè)條帶，說(shuō)明其RNA提取是成功的.

2.2 煙草Mlo基因克隆結(jié)果

2.2.1 RT-PCR結(jié)果檢測(cè).

將提取到的煙草RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到煙草cDNA.利用設(shè)計(jì)的P1、P2引物經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，擴(kuò)增產(chǎn)物的目的片段均在1 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果951 bp較為符合.

2.2.2 PCR產(chǎn)物與T載體連接結(jié)果.

PCR產(chǎn)物與T載體連接結(jié)果如圖4所示.

圖3煙草Mlo基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4基因片段與T載體連接圖

由圖4可知，樣品1、6、8、10、11比其他剩余的樣品分子量小，說(shuō)明這5個(gè)樣品中載體沒(méi)與基因片段連接上，剩余的樣品已連接成功.

2.2.3Mlo基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果.

Mlo基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如下，

由產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果可知，其31～945處的堿基為煙草Mlo基因編碼的開(kāi)放閱讀框(ORF)，大小為915 bp.下劃線部分別為上游和下游引物的位置，加粗部分分別為起始和終止密碼子.結(jié)果表明，從煙草中成功克隆到了與預(yù)期大小一致的Mlo基因.

利用上述獲得的Mlo基因，由Bioedit軟件得到Mlo基因的反義序列如下，

其中，引物A，帶有Xba I酶切位點(diǎn)，為，

GCTCTAGAGTTAGCAGCAGCTTGTGGACAAC

引物B，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，為，

CGGGATCCTGAGATCTGTGGAATCCATAG

2.3 反義片段擴(kuò)增結(jié)果

反義片段擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示.

1，2為反義擴(kuò)增樣品

圖5反義片段擴(kuò)增電泳圖

由圖5可知，樣品電泳片段大小在500～1 000 bp之間，由Bioedit軟件得到Mlo基因的反義序列大小是577 bp，表明反義片段擴(kuò)增成功.切下擴(kuò)增的條帶用小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，并與T載體進(jìn)行連接，再測(cè)序.

2.4 反義片段載體連接結(jié)果

反儀片段載體連接結(jié)果如圖6所示.

圖6反義片段載體電泳圖

由圖6可知，除了第4、8、11以外，其他反義片段擴(kuò)增成功.

2.5 反義片段測(cè)序結(jié)果

反義片段測(cè)序結(jié)果如下，下劃線部分為設(shè)計(jì)的反義引物.

2.6 構(gòu)建反義表達(dá)載體雙酶切電泳結(jié)果

用已通過(guò)連接的pBI 121-Mlo熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109.經(jīng)Kan篩選出反義重組菌落，利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒后進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖7所示.

圖7反義表達(dá)載體雙酶切電泳圖

因?yàn)檩d體PBI 121和反義片段具有相同的酶切位點(diǎn).由圖7可以看出，樣品1和樣品2分別產(chǎn)生了0.6 kb和2.4 kb的基因片段，說(shuō)明目的片段成功插入PBI 121.此表明，煙草Mlo基因反義表達(dá)載體構(gòu)建成功，圖7中PBI 121-Mlo為已構(gòu)建成功的反義表達(dá)載體.

3 結(jié) 論

本研究以煙草的無(wú)菌苗葉片為材料，利用RT-PCR方法成功克隆了一個(gè)Mlo基因，同時(shí)，通過(guò)反義引物克隆Mlo基因的反義片段，測(cè)序后成功找到設(shè)計(jì)的反義片斷，并利用反義引物成功擴(kuò)增了Mlo基因的反義片段.

反義片段與載體pBLUE-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，Kan實(shí)驗(yàn)提質(zhì)粒后，用反義片段構(gòu)建的pBI 121載體經(jīng)Bam HI和XBaI雙酶切，其電泳圖可以看見(jiàn)樣品分為0.6 kb和2.4 kb兩類(lèi)大小的目的片段，說(shuō)明插入成功，即成功構(gòu)建了煙草Mlo基因反義表達(dá)載體.

利用反義RNA技術(shù)[10]獲得煙草Mlo基因的缺陷性植株的關(guān)鍵是獲取煙草反義Mlo基因.本研究從煙草葉片中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Mlo基因的cDNA，并以此為模板，設(shè)計(jì)反義引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出反義Mlo基因.其中反義Mlo基因的長(zhǎng)短選擇極為重要，因?yàn)榉戳xMlo基因過(guò)短可能無(wú)法起到抑制Mlo基因表達(dá)的作用，而過(guò)長(zhǎng)則會(huì)給連接載體造成困難.對(duì)此，本研究選擇了長(zhǎng)為577 bp的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和反義序列擴(kuò)增，以確保反義Mlo基因既能很好地與載體連接，又能抑制Mlo基因的表達(dá).

由反義Mlo基因與植物表達(dá)載體pBI 121進(jìn)行連接后的產(chǎn)物的雙酶切電泳鑒定結(jié)果可知，本研究已成功構(gòu)建了煙草反義Mlo基因表達(dá)載體pBI 121-Mlo，并有望將攜帶反義Mlo基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，獲得該基因表達(dá)的缺陷型植株，進(jìn)而研究其在煙草抗病方面的負(fù)調(diào)控作用.

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ConstructionofTobaccoAnti-senseMloGeneExpressionVector

WUXiaoyong,SHIYujie,LIJie,LUOQian,WANGYuehua,TANGYuan,SUNYanxia

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Tobacco anti-senseMlogene plant expression vector PBI 121-Mlowas constructed not only for tobacco genetic transformation,but also to lay the foundation for the defective plant gene expression.Total RNA was extracted from tobacco leaves and the cDNA ofMlowas obtained by PT-PCR amplification.The cDNA was served as a template to amplify the anti-senseMlogene by the anti-sense primers.Then the anti-senseMlogene was connected with T vector and sequenced and then the anti-sense fragment was connected to the plant expression vector named pBI 121.The plant expression vector of the tobacco anti-senseMlonamed pBI121-Mlowas constructed.The recombinant bacteria were selected through Kanamycin and a few plasmids were extracted by alkaline lysis method.The plasmid was identified by electrophoresis after double digestion by Xba I and BamH I.The results illustrated that the target gene was successfully connected to the plant expression vector pBI 121.The genetic expression vector named pBI 121-Mloof tobacco anti-senseMlowas constructed.

Mlogene;pBI 121-Mlo；RT-PCR；anti-sense fragment;double digestion

S572.032

A

1004-5422(2017)04-0333-05

2017-09-09.

成都大學(xué)藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(10Y201409)資助項(xiàng)目.

鄔曉勇(1975 — )，男，博士，副教授，從事植物天然產(chǎn)物研究.