門翔，尚喜雨

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 南陽 473000；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473000）

MMP-9和COX-2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究

門翔1，尚喜雨2

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 南陽 473000；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473000）

目的探討MMP-9和COX-2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系。方法選取71例慢性阻塞性肺疾病患者（COPD組）和同期63例急性呼吸道感染和健康體檢者（NC組）作為研究對象，PCRRFLP法測定MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）多態(tài)性，分析不同基因型與COPD的關(guān)系。結(jié)果NC組與COPD組MMP-9（R279Q）基因、COX-2（1195G＞A）的GG、AA基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010和0.021），G、A等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。MMP基因R279Q位點的G等位基因頻率基因 1195G＞A 位點的 A 等位基因頻率為COPD的危險因素。MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多態(tài)性與FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關(guān)性（P=0.015、0.018、0.009、0.009，0.021、0.017、0.015和0.000）。結(jié)論MMP-9基因R279Q位點、COX-2基因1195G＞A位點多態(tài)性為COPD的危險因素，與FEV1%pred、FEV1/FVC下降及MMP-9、COX-2升高相關(guān)。

慢性阻塞性肺疾??；基質(zhì)金屬蛋白酶9；環(huán)氧化酶2；基因多態(tài)性

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以持續(xù)氣道阻塞為臨床表現(xiàn)的一種慢性進展性疾病，氣道和肺內(nèi)對有害物質(zhì)有慢性炎癥反應(yīng)增強的表現(xiàn)[1]。目前，COPD死亡率居全球第4位，世界疾病經(jīng)濟負(fù)擔(dān)指數(shù)居全球第5位，該病嚴(yán)重危害人民的健康。COPD的發(fā)病機制十分復(fù)雜，環(huán)境和遺傳因素日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)[2]，炎癥反應(yīng)貫穿COPD的發(fā)生發(fā)展過程。有報道指出，基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）與COPD的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，但目前對于MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）與COPD的關(guān)系研究報道較少。本研究旨在探討上述2種基因多態(tài)性與COPD的關(guān)系，從而為臨床基因靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2015年1月-2016年4月在南陽市中心醫(yī)院呼吸科住院診治的COPD患者71例（COPD組），其中，男性49例，女性22例，年齡45～76歲，平均（64.22±7.08）歲，通過體格檢查、詢問病史、胸部CT或X射線胸片同時結(jié)合肺功能、心電圖等證實為COPD，所有患者均符合2007年版《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；另選取同一時期在本院呼吸科門診就診的急性呼吸道感染和健康體檢者63例（NC組），其中，男性40例，女性23例，年齡42～71歲，平均（62.41±6.89）歲，均未出現(xiàn)慢性咳嗽、咳痰、氣短史等，經(jīng)胸部CT或X射線胸片和肺功能（FEV1/FVC＞70%）檢查排除COPD。

1.2 一般臨床資料及生化指標(biāo)檢測

詢問并記錄所有受試對象年齡、性別、吸煙史、吸煙指數(shù)，記錄肺功能指標(biāo)：第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比（percentage of forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1%pred），F(xiàn)EV1/FVC（受試對象吸入支氣管擴張劑沙丁胺醇15 min后檢測）。抽取患者外周靜脈血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的真空管中，離心后獲得血漿，采用ELISA檢測血漿中MMP-9。

1.3 外周血標(biāo)本及DNA提取

采集受試對象外周靜脈血5 ml，置于含有EDTA的真空管中，-80℃冰箱中保存。取血樣標(biāo)本2 ml，采用基因組DNA快速提純試劑盒（Promega生物試劑公司，美國）提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性應(yīng)用

1.4.1 引物合成 按照相關(guān)文獻[5]設(shè)計引物，由上海英駿生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design軟件設(shè)計MMP-9和COX-2基因相應(yīng)位點引物，均采用小片段擴增引物。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物：其中MMP-9（R279Q）（G）正向：5'-CATCGCTACTATTCTGGCCTTAAAGCGCATA-3'，反向：5'-GGCCTATAAGGGCCGAGCGGGTCGTAGGCC ATC-3'，PCR產(chǎn)物片段的長度在237 bp；COX-2（1195G＞A）（G）正向：5'-CCGGTACATGGCCTATTAAC GTGCATACGG-3'，反向：5'-CGTTGCGCAATGCTGAC CGATCA-3'，PCR產(chǎn)物片段的長度在124 bp。

1.4.2 目的基因擴增 PCR擴增體系為25 ml，其中含有5 ml PCR 混合物，正反向引物各0.5 ml，1 ml LC Green和1 ml DNA模板，剩余加入雙蒸水。MMP-9（R279Q）的擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，945℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 45 s，94℃變性30 s，30℃退火30 s，共計40個循環(huán)，完成后采用73℃延伸5 min，限制性內(nèi)切酶為MspⅠ；COX-2（1195G＞A）的擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，93℃變性30 s，55℃退火30 s，73℃延伸45 s，93℃變性45 s，45℃退火30 s，共計40個循環(huán)，完成后采用72℃延伸5 min，限制性內(nèi)切酶為RsaⅠ。取PCR產(chǎn)物10μl，在含有2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴增是否成功，鑒定其特異性。全部測序均由ABI3100測序分析儀（美國ABI公司）完成。為準(zhǔn)確測定基因分型結(jié)果，隨機選取10%的樣本采用直接測序法進行驗證。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗。群體基因型采用Hardy-Weinberg平衡檢驗?；蚨鄳B(tài)性與COPD的遺傳效應(yīng)之間的相關(guān)性采用非條件的Logistic回歸分析，并經(jīng)多重檢驗P值的Bonferroni進行校正。ROC曲線分析MMP-9、COX-2對COPD的預(yù)測價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料及生化指標(biāo)檢測結(jié)果

兩組FEV1%pred、FEV1/FVC比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），COPD組低于NC組，兩組MMP-9及COX-2比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），COPD組高于NC組。見表1。

2.2 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型及擴增結(jié)果

MMP-9（R279Q）位點酶切中呈現(xiàn)1條亮的且長度為124 bp的條帶為AA型，出現(xiàn)58、66和124 bp 3條亮帶的為GA型，出現(xiàn)在58和66 bp 2條帶為GG型；COX-2（1195G＞A）位點酶切中呈現(xiàn)1條亮的且長度為237 bp的條帶為AA型，出現(xiàn)53、220和237 bp 3條亮帶的為GA型，出現(xiàn)在53和220 bp 2條帶為GG型。隨機選取MMP-9（R279Q）基因型、COX-2（1195G＞A）的PCR擴增產(chǎn)物行基因測序，結(jié)果顯示堿基的改變與酶切結(jié)果一致。見圖1。

2.3 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型分布比較

NC 組 與 COPD 組MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）位點G、A等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明符合群體代表性。NC組與COPD組MMP-9（R279Q）基因GG、AA基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010），G、A等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；NC組與COPD組COX-2（1195G＞A）基因GG、AA基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021），G、A等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。見表2。

表1 兩組一般臨床資料及生化指標(biāo)檢測結(jié)果

圖1 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因擴增電泳圖

2.4 COPD危險因素的多變量回歸分析

將臨床資料與生化檢測指標(biāo)中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素行多變量的Logistic回歸分析，以子COPD為因變量，以FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9和R279Q基因的G等位基因頻率、COX-2和1195G＞A的A等位基因頻率為自變量。結(jié)果顯示，F(xiàn)EV1%predR279Q基因的G等位基因頻率1195G＞A基因的A等位基因頻率為COPD的危險因素。

2.5 MMP-9、COX-2對COPD的預(yù)測價值

ROC曲線分析顯示，Youden指數(shù)在最大時，MMP-9、COX-2臨界值分別為 53.26μg/L、75.15 ng/ml，曲線AUC顯示，MMP-9、COX-2的AUC分別為0.754、0.779（P=0.017和0.012）。見圖2、表3。

2.6 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）與COPD影響因素的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多態(tài)性與FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關(guān)性（P=0.015、0.018，0.009、0.009，0.021、0.017、0.015 和 0.000）。見表 4。

表2 兩組MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）基因型分布比較

表3 MMP-9、COX-2診斷效能分析

表4 MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）與COPD影響因素的關(guān)系 例（%）

圖2 MMP-9、COX-2 的ROC曲線

3 討論

COPD是一種臨床表現(xiàn)為不完全可逆、呈進行性發(fā)展的氣流阻塞為特征的疾病，該病主要是由長期氣道阻塞導(dǎo)致患者肺泡缺氧以及二氧化碳潴留，引起肺血管收縮、肺血管重構(gòu)，從而導(dǎo)致肺動脈高血壓、易出現(xiàn)COPD患者出現(xiàn)右心衰竭和死亡[6]。肺血管重塑是導(dǎo)致COPD進一步發(fā)生惡化的關(guān)鍵原因，導(dǎo)致肺血管重塑的原因有慢性炎癥、低氧或者缺氧等。低氧導(dǎo)致肺內(nèi)高血壓，從而促進肺動脈纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂因子、生長因子的釋放，而這些因子的釋放進一步促進平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖并進一步刺激細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致肺動脈血管壁增厚，加重氣道阻塞[7]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，環(huán)境和基因因素在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中存在著相互影響，關(guān)系很復(fù)雜。研究COPD的易感基因其相關(guān)因素對于防治COPD具有重要意義：①通過研究COPD的易感基因可以確定COPD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，從而尋找基因治療的靶點；②對易感基因人群進行早期篩查和診斷，有助于早期應(yīng)用藥物進行干預(yù)，同時根據(jù)不同個體制定個體化COPD治療方案。

COPD的發(fā)病機制目前尚不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)中的重要成員，與冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、高血壓、2型糖尿病、肺癌、COPD以及腫瘤轉(zhuǎn)移等有一定的關(guān)系[8]，MMPs成員中MMP-1、9和12均與COPD、肺氣腫的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中MMP-9是位于染色體20q11和2q13.1，具有13個外顯子和9個內(nèi)含子[9]。目前有研究報道[10]，MMP-9基因C-1 562T位可能存在C突變成T，而這種突變將影響到MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄從而引發(fā)疾病，也有研究證實了MMP-9基因R279Q位點多態(tài)性可能為COPD易感性的危險因素。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，證實了MMP-9基因R279Q位點多態(tài)性與COPD相關(guān)，值得提出的是本研究進一步探討了MMP-9基因R279Q位點A突變成G基因與FEV1%pred、FEV1/FVC降低以及MMP-9、COX-2升高相關(guān)，說明MMP-9基因R279Q位點多態(tài)性對COPD患者肺功能、炎癥反應(yīng)有明顯的刺激作用，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。

COX-2是由花生四烯酸代謝過程中的重要限速酶，在前炎癥因子的刺激下，機體處于驗證狀態(tài)后其呈高表達[11]。有文獻報道指出，COX-2與多種炎性介質(zhì)相互參與了COPD患者氣道炎癥反應(yīng)過程，如IL-1、MMP-2、MMP-9等[12]，這也是本研究選擇COX-2、MMP-9作為研究對象的原因，旨在探討二者相互作用促進COPD的發(fā)生發(fā)展。COX-2基因的表達及其穩(wěn)定性受到啟動子區(qū)和3’端非編碼區(qū)的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響，因此其調(diào)控區(qū)域可能存在多態(tài)性改變從而影響基因表達，進而改變機體對疾病的易感性。目前有研究報道指出[13]，COX-2基因765G＞C位點基因多態(tài)性可能為COPD的易感基因位點。目前對于COX-2基因1195G/A基因位點與與膀胱癌、老年人阿司匹林抵抗有關(guān)[14]，而與COPD的關(guān)系研究報道較少。通過本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2基因1195G＞A的A等位基因頻率為COPD的危險因素，進一步研究證實發(fā)現(xiàn)，COX-2（1195G＞A）基因多態(tài)性 與 FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關(guān)性，說明MMP-9基因R279Q位點多態(tài)性對COPD患者肺功能、炎癥反應(yīng)有明顯的刺激作用，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。

需要指出的是，本研究采用ROC曲線分析MMP-9、COX-2對COPD的預(yù)測價值，主要有2個方面的原因：①MMP-9、COX-2均已證實通過參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展，通過繪制ROC曲線分析2者在COPD中的預(yù)測價值，為臨床診斷COPD進程提供依據(jù)；②繪制ROC曲線，分析獲得MMP-9、COX-2的最佳臨界值，從而有利于臨床COPD的發(fā)生，也便于MMP-9基因R279Q位點、COX-2基因1195G＞A位點與MMP-9、COX-2的關(guān)系研究。

綜上所述，MMP-9基因R279Q位點、COX-2基因1195G＞A位點多態(tài)性為COPD的危險因素，與FEV1%pred、FEV1/FVC下 降 及MMP-9、COX-2升高相關(guān)。

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Association ofMMP9andCOX2gene polymorphisms with chronic obstructive pulmonary disease

Xiang Men1, Xi-yu Shang2(1. Department of Respiratory Medicine, Nanyang City Center Hospital, Nanyang, Henan 473000, China;2. Nanyang Medical College, Nanyang, Henan 473000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenMMP9andCOX2gene polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease.MethodsA total of 71 patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD group) and 63 cases of acute respiratory infection and healthy persons as the objects of study. PCR-RFLP method was used to determine the polymorphisms ofMMP9(R279Q) andCOX2(1195G＞A). The relationships between different genotypes and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) were analyzed.ResultsDifferences inMMP9gene R279Q and GG and AA genotypes ofCOX2(1195G＞A) between the NC group and the COPD group had statistical significance (P= 0.010 and 0.021), the differences in the frequency of G and A alleles had statistical significance (P= 0.000). The G allele frequency atMMP9R279Q locusand the A allele frequency ofCOX2gene 1195G＞A locuswere the risk factors for COPD.MMP9R279Q andCOX21195G＞A polymorphisms had correlations with FEV1%pred, FEV1/FVC, MMP-9 and COX-2 (P= 0.015, 0.018, 0.009, 0.009, 0.021, 0.017, 0.015 and 0.000 respectively).ConclusionsMMP9gene R279Q andCOX2gene 1195G＞A polymorphisms are the independent risk factors for COPD, and correlated with decrease of FEV1%pred and FEV1/FVC and increase of MMP-9 and COX-2.

chronic obstructive pulmonary disease; matrix metalloproteinase 9; cyclooxygenase 2; gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.010

1005-8982（2018）01-0050-06

2017-02-16

尚喜雨，E-mail：shangxiyu163@163.com；Tel：13525660096

R563.9

A

（張西倩 編輯）