卞俊杰，李醒亞，郭偉華，田國(guó)防，貴永賢，呂振選

（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052）

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用研究

卞俊杰1，李醒亞2，郭偉華1，田國(guó)防1，貴永賢1，呂振選1

（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052）

目的探討干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（IFITM 3）在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中IFITM 3的表達(dá)水平。細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-IFITM 3抑制IFITM 3的表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)染si-control作為對(duì)照，MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果IFITM 3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。si-IFITM 3組結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116的存活率與si-control組相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-IFITM 3后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116凋亡率高于si-control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-IFITM 3后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116中STAT3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化，p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于si-control組，Bax蛋白表達(dá)水平高于si-control組。結(jié)論干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3在結(jié)腸癌組織中過(guò)度表達(dá)。抑制干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3的表達(dá)，可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與Bcl-2、Bax、STAT3有關(guān)。

結(jié)腸癌；干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3；凋亡；增殖

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的發(fā)生于消化道的惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有胃腸道惡性腫瘤中位居第2位[1]。結(jié)腸癌多發(fā)生于40歲以后的人群，其中男性的發(fā)病率為女性發(fā)病率的2倍[2]。在中國(guó)，結(jié)腸癌每年死亡人數(shù)在全部惡性腫瘤中位居第5位[3]。環(huán)境、生活方式、飲食習(xí)慣等多種因素都可引發(fā)結(jié)腸癌。結(jié)腸癌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白（interferon-induced transmembrance，IFITM）廣泛存在于不同種屬的細(xì)胞內(nèi)。IFITM 3具有廣泛的抗病毒作用[4]。近年來(lái)研究表明，IFITM在乳腺癌組織中高表達(dá)，沉默IFITM 3基因的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯降低[5]。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測(cè)IFITM 3基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平，探討IFITM 3基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞的增殖凋亡作用，以期為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞及組織 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。人結(jié)腸癌組織及正常的癌旁組織各50例來(lái)自2011年1月-2014年6月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院確診治療的結(jié)腸癌患者。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、MTT、Trizol細(xì)胞裂解液、Annexin V-FITC、PI、Loading buffer、PVDF膜、DMSO溶液均購(gòu)自于北京鼎國(guó)生物試劑有限公司，Bcl-2多克隆抗體、Bax多克隆抗體、p-STAT3多克隆抗體、STAT3多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗均購(gòu)自于杭州聯(lián)科生物科技有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自于上海精密儀器表公司，二氧化碳CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)IFITM 3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) 收集的50例結(jié)腸癌組織和正常的癌旁組織剪碎后，加入適量的Trizol細(xì)胞裂解液，充分混合后，放置于室溫下裂解5 min。在裂解液中加入氯仿200μl，上下劇烈搖晃20次，放在室溫下靜置5 min。14 000 r/min，4℃離心15 min，用移液槍吸取上層水相層至新的EP管中，每個(gè)EP管中加入500μl的異丙醇后，放置于冰上靜置10 min。14 000 r/min，4℃離心15 min。收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗滌后，放置于室溫條件下晾干，加入DEPC水溶解后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度及純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成IFITM 3的cDNA，qRT-PCR檢測(cè)IFITM 3表達(dá)水平。正向引物：5'-TGTCCAAACCTTCTTCTC-3'，反向引物：5'-CGTCG CCAACCATCTTCC-3'。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，濕度為95%，5% CO2培養(yǎng)箱。觀察細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min后，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入2 ml細(xì)胞懸液。放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞融合度為60%左右時(shí)，按照常規(guī)方法將IFITM 3抑制物（si-IFITM 3）轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染si-control作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后6 h更換為含有胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)液，放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞濃度使每孔中細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×103個(gè)。同時(shí)設(shè)置空白組，空白組中不加入細(xì)胞，加入等量的細(xì)胞生長(zhǎng)液。每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。培養(yǎng)48 h后，在細(xì)胞中加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔加入20μl。放置于37℃繼續(xù)孵育4 h后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，在細(xì)胞中加入DMSO溶液，每孔中加入100μl。充分混合后，觀察結(jié)晶物完全融化后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處每孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min離心10 min后，加入提前預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。在細(xì)胞中加入Annexin V-FITC和PI各5μl后，充分混合，放置于室溫下孵育20 min。加入400μl的結(jié)合緩沖液，混合均勻后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3表達(dá)水平 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞，棄掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，在細(xì)胞中加入含有PMSF濃度為1%的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，每個(gè)6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入200μl體積的細(xì)胞裂解液。放置于冰上充分裂解40 min，觀察細(xì)胞完全裂解后，12 000 r/min，4℃離心15 min。取上清液，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。將提取的蛋白樣品與5×Loading buffer充分混合后，放置于100℃水浴鍋中煮沸5 min。取50μl變性蛋白樣品加入到上樣孔中，蛋白凝膠用12%分離膠和5%濃縮膠。電泳初始電壓為80 V，終末電壓為120 V。電泳結(jié)束后，蛋白凝膠在4℃轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜電壓為90 V。轉(zhuǎn)膜后，PVDF膜依次與一抗、二抗孵育反應(yīng)后，在暗室中曝光，分析蛋白表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFITM 3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

收集的50例結(jié)腸癌組織和正常的癌旁組織經(jīng)RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，qRT-PCR檢測(cè)IFITM 3水平。結(jié)果顯示，IFITM 3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.371，P=0.001）。見(jiàn)圖 1。

2.2 細(xì)胞增殖結(jié)果

收集轉(zhuǎn)染si-IFITM 3和si-control后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-IFITM 3后，結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116的存活率與si-control組相比下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tHT29=6.438，PHT29=0.001；tHCT116=5.984，PHCT116=0.002）。見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖1 IFITM 3在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

圖2 IFITM 3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響

收集轉(zhuǎn)染si-IFITM 3和si-control后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，經(jīng)Annexin V-FITC和PI雙染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-IFITM 3后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116凋亡率高于si-control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tHT29=6.158，PHT29=0.002；tHCT116=8.967，PHCT116=0.000）。見(jiàn)圖 3。

2.4 細(xì)胞中 Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3 表達(dá)結(jié)果

圖3 IFITM 3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響

收集轉(zhuǎn)染si-IFITM 3和si-control后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞總蛋白提取，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖4顯示：與si-control組相比，si-IFITM 3組HT29-p-STAT3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.897，P=0.000），與si-control組相比，si-IFITM 3組HT29-Bcl-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.217，P=0.001），與si-control組相比，si-IFITM 3組HT29-Bax表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.384，P=0.001）；與si-control組相比，si-IFITM 3組HCT116-p-STAT3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.054，P=0.000），與 si-control組相比，si-IFITM 3組HCT116-Bcl-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.587，P=0.001），與si-control組相比，si-IFITM 3組HCT116-Bax表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.035，P=0.000）。轉(zhuǎn)染si-IFITM 3后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和HCT116中STAT3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化，p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于si-control組，Bax蛋白表達(dá)水平高于si-control組。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病。結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率極高，尤其是近年來(lái)隨著人們生活水平的不斷提高，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[6]。研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于治療和診斷結(jié)腸癌的發(fā)生具有重要意義。

IFITM 3是IFITM蛋白家族中的一員[7]。最早發(fā)現(xiàn)IFITM在抗病毒方面具有重要作用，對(duì)肝炎病毒、艾滋病病毒、巨細(xì)胞病毒等都具有防御作用。IFITM的抗腫瘤作用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[8-9]。IFITM在宮頸癌、膠質(zhì)瘤等頭頸部的腫瘤中過(guò)度表達(dá)[10-11]。幽門螺旋桿菌感染的浸潤(rùn)癌以及胃癌前的病變中IFITM異常高表達(dá)[12]。IFITM 3在乳腺癌、肝癌中高表達(dá)，沉默IFITM 3后，肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力明顯降低[13-14]。本研究收集了50例結(jié)腸癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IFITM 3在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，與癌旁組織相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染si-IFITM 3后，MTT檢測(cè)了轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，沉默IFITM 3表達(dá)可以抑制直腸癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一種正常的生物學(xué)現(xiàn)象[15]。在某些病理?xiàng)l件下，細(xì)胞增殖和凋亡不能維持正常的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生。細(xì)胞凋亡受多種基因的復(fù)雜調(diào)控。Bcl-2蛋白家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2蛋白家族中的成員，Bcl-2在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮抑制作用，而B(niǎo)ax發(fā)揮促進(jìn)作用[16]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子STAT3是STAT家族中的一員，在STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用[17]。STAT3參與乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[18-19]。STAT3在腫瘤中異常活化，是一種具有致癌作用的潛在因子[20]。本研究中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞沉默IFITM 3后的細(xì)胞凋亡情況，沉默IFITM 3后2種結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率均升高。Western blot檢 測(cè) Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)沉默IFITM 3后，結(jié)腸癌細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)升高，而B(niǎo)cl-2、p-STAT3表達(dá)受到抑制。這提示，IFITM 3可以通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax、p-STAT3表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，IFITM 3在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)。沉默IFITM 3后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡增加，其作用機(jī)制與Bcl-2、Bax、STAT3有關(guān)。這為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為診斷和治療結(jié)腸癌提供了新方向。

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Expression of IFITM3 in colon cancer tissue and its effect on apoptosis of colon cancer cells

Jun-jie Bian1, Xing-ya Li2, Wei-hua Guo1, Guo-fang Tian1, Yong-xian Gui1, Zhen-xuan Lü1
(1. Department of Medical Oncology, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang, Henan 453000, China;2. Department of Oncology, the First Aff i liated Hospital, Zhengzhou University,Zhengzhou, Henan 450052, China)

ObjectiveTo investigate the expression of interferon-induced transmembrane 3 (IFITM3) in colon cancer tissues and its effect on the apoptosis of colon cancer cells.MethodsThe expression level of IFITM3 in colon cancer tissues and corresponding adjacent tissues was detected by qRT-PCR. Colon cancer cells were transfected with si-IFITM3, while si-control was used as a control. The proliferation of the transfected cells was detected by MTT.Cell apoptosis was detected by fl ow cytometry. Western blot was used to detect the expression levels of Bcl-2, Bax,p-STAT3 and STAT3 proteins in the cells.Results The expression level of IFITM3 in the colon carcinoma tissues was signi fi cantly higher than that in the adjacent tissues, and the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05).The survival rates of colon cancer HT29 and HCT116 cells of the si-IFITM3 groups were signi fi cantly decreased compared with those of the si-control groups (P＜ 0.05). The apoptosis rates of colon cancer HT29 and HCT116 cells of the si-IFITM3 groups were signi fi cantly higher than those of the si-control groups, and the differences were statistically signi fi cant (P＜ 0.05). The expression levels of STAT3 in the si-IFITM3-transfected HT29 and HCT116 cells did not change compared with those in the si-control groups, but the expressions of p-STAT3 and Bcl-2 protein were significantly lower than those in the si-control groups, and Bax protein expression levels were significantly higher than those in the si-control groups.ConclusionsIFITM3 is over-expressed in colon cancer tissues. Inhibition of IFITM3 expression can inhibit the proliferation of colon cancer cells and promote the apoptosis of the cancer cells,its mechanism is related to Bcl-2, Bax and STAT3.

colon cancer; IFITM3; apoptosis; proliferation

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.009

1005-8982（2018）01-0044-06

2017-02-13

R735.3

A

（張西倩 編輯）