魏艷杰 ，彭子荷 ，李晨浩 ，郝帥林 ，張媛 ，李朝陽 ，肖童 ，郝小惠，劉和亮，田煒，王宏麗

（1.華北理工大學 醫(yī)學實驗研究中心，河北 唐山 063210；2.河北省滄州中心醫(yī)院，河北滄州 061014；3.華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北 唐山 063210）

羥基喜樹堿對人肺癌A549細胞自噬的影響*

魏艷杰1，彭子荷1，李晨浩2，郝帥林1，張媛1，李朝陽1，肖童1，郝小惠1，劉和亮1，田煒1，王宏麗3

（1.華北理工大學 醫(yī)學實驗研究中心，河北 唐山 063210；2.河北省滄州中心醫(yī)院，河北滄州 061014；3.華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北 唐山 063210）

目的探究羥基喜樹堿（HCPT）對人肺癌A549細胞自噬的作用。方法體外進行肺癌A549細胞的培養(yǎng)，分別使用50、200和400μmol的HCPT處理，利用MTT法檢測HCPT對細胞存活率的影響；共聚焦顯微鏡成像技術觀察HCPT對細胞自噬活性的影響；Western blot檢測HCPT對自噬相關蛋白LC3、p-mTOR表達的影響。結果HCPT抑制A549細胞的活性；HCPT處理24 h后細胞質和細胞核周圍Cyto-ID綠色熒光強度增強；與對照組比較，HCPT治療各組LC3II/I值升高，p-mTOR表達減少；且加入自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤（3-MA）處理后的各組與相對應的HCPT治療各組比較，A549細胞的增殖抑制增強。結論HCPT能抑制A549細胞增殖并誘導其發(fā)生自噬；HCPT發(fā)揮抑制A549細胞增殖作用可能與自噬密切相關；抑制細胞自噬可能會增強HCPT的抗A549細胞增殖能力。

肺癌；自噬；羥基喜樹堿；3-MA；mTOR

近年來數(shù)據(jù)顯示，肺癌嚴重危害人類健康，全球范圍內肺癌的發(fā)病率和死亡率增加[1]。隨著我國經濟的發(fā)展和環(huán)境污染的加劇，肺癌已成為各種癌癥死亡的首要原因[2]。在肺癌的治療方面，目前化療仍然是重要的輔助治療手段，但化療過程中腫瘤細胞的耐藥性及其抗凋亡能力是妨礙多種腫瘤治愈的主要原因之一。近年來，細胞自噬與腫瘤之間的關系在腫瘤研究領域已成為熱點。最新研究顯示，自噬與腫瘤的發(fā)生、浸潤及轉移存在密切的關系，因此自噬有望成為腫瘤治療中新的靶點。

羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）是一種廣譜抗腫瘤藥物，但其抑制腫瘤細胞的具體機制尚不明確[3]。因此本研究擬通過觀察HCPT對人肺癌A549細胞自噬的影響，以期為其今后的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)

A549細胞購自中國科學院細胞庫。A549細胞株在5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中，貼壁生長至80%～90%時，0.25%胰酶消化傳代。

1.2 主要試劑與儀器

HCPT（純度＞99%）由百靈威科技有限公司提供，6-氨基-3-甲基嘌呤（3-MA）、雷帕霉素（RAPA）和兔源LC3B多克隆抗體均購于美國Sigma公司，細胞增殖及毒性檢測試劑盒（MTT）為石家莊天舜生物科技有限公司產品，Cyto-ID Autophagy Detection Kit（ENZ-51031-K200）為美國Enzo life science產品。37℃二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司），半干轉運系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），JY200C電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），激光共聚焦顯微鏡FV1000（日本Olympus公司）。

1.3 體外藥物敏感的MTT法檢測

選取對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好的細胞重復細胞培養(yǎng)步驟，用新培養(yǎng)基使細胞重懸混勻，在96孔板每孔中加入200μl含有大約3 000個細胞的細胞懸液，細胞貼壁后，每孔加入不同劑量HCPT培養(yǎng)液200μl（對照組加普通培養(yǎng)液），HCPT+3-MA組在HCPT處理前1 h加3-MA（5 mmol）處理，每組設5個復孔。培養(yǎng)24 h后每孔分別加入MTT（0.5%MTT）溶液20μl，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μl，15 min后顯微鏡下觀察到藍色結晶物完全溶解，于570 nm波長用酶標儀測定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測自噬發(fā)生情況

選取對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好的細胞，消化離心后置于共聚焦小皿內培養(yǎng)，待細胞貼壁生長達到50%～70%后，每皿加入不同濃度HCPT培養(yǎng)液2 ml（對照組用普通培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并設陽性對照組（RAPA組）。按CYTO-ID?Autophagy Detection Kit試劑盒說明書加入Hoechst 33342 Nuclear Stain、CYTO-ID?Green Detection Reagent 37℃避光孵育30 min，置于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.5 Western blot檢測自噬相關蛋白LC3、p-mTOR表達

LC3在自噬過程中具有標志性的作用，其在細胞內有2種存在形式（LC3I、LC3II），自噬體的形成過程中伴隨著LC3I向LC3II的轉變。因此LC3II/LC3I值可以反映自噬發(fā)生情況。p-mTOR是細胞自噬的負性調控蛋白。重復細胞傳代步驟，用細胞培養(yǎng)液重懸細胞并充分混勻，每個小皿內加入2 ml細胞懸液，培養(yǎng)過夜。實驗分為對照組（加入普通培養(yǎng)液）、HCPT組（50、200和 400μmol）、HCPT+3-MA組， 處 理24 h后收集細胞。通過裂解細胞、提取細胞總蛋白進行蛋白濃度測定后，運用Western blot檢測LC3、p-mTOR的表達。用Image J進行灰度掃描及定量分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組均值比較采用完全隨機設計的單因素方差分析（One-way，ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCPT對A549細胞活性的影響

MTT法測定A549細胞的存活率，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=186.662，P=0.000），各組細胞的存活率有差別；進一步兩兩比較顯示，與對照組比較，HCPT組（50、200和400μmol）中細胞相對存活率間差異有統(tǒng)計學意義（t=13.614、12.614和44.679，均P=0.000），見附表。表明HCPT劑量越大，其抑制A549細胞的增殖能力越強。

附表 不同劑量HCPT對A549細胞活性的影響 （n =10）

2.2 HCPT對細胞自噬的影響

2.2.1 細胞自噬結果 與對照組比較，HCPT組處理24 h后細胞質和細胞核周圍Cyto-ID綠色熒光強度增強，與經典的自噬誘導劑RAPA處理后情況相似，其中200μmol HCPT組Cyto-ID綠色熒光強度增強尤為明顯，說明HCPT可以誘導A549細胞自噬發(fā)生，且其誘導A549細胞自噬發(fā)生的能力與用藥劑量有關。見圖1。

2.2.2 細胞自噬相關蛋白LC3的表達結果 Western blot檢測各組LC3II/LC3I值的變化，LC3II/LC3I值在 對 照 組、50μmol HCPT組、200μmol HCPT組、400μmol HCPT 組表達為（100.0±2.12）、（107.07±0.94）%、（136.36±0.62）% 和（125.25±1.31）%，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=855.315，P=0.000），各組LC3II/LC3I值有差別；進一步兩兩比較顯示，與對照組比較，HCPT組（50，200，400μmol）中LC3II/LC3I值差異有統(tǒng)計學意義（t=-6.625、-38.147和 -23.203， 均P=0.000）。200μmol HCPT組LC3II/LC3I值上升最為顯著。進一步說明，HCPT可誘導A549細胞自噬活性增強，其誘導A549細胞自噬的能力與劑量有關。見圖2。

2.2.3 細胞自噬相關蛋白p-mTOR的表達結果Western blot檢測各組p-mTOR水平的變化，p-mTOR在 對 照 組、50μmol、200μmol及 400μmol HCPT組 表 達 為（100.00±7.36）%、（95.61±7.41）%、（70.29±6.67）%及（49.53±5.42）%，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=716.920，P=0.000），各組p-mTOR水平有差別；進一步兩兩比較顯示，與對照組比較，HCPT組（50、200和400μmol）p-mTOR水平差異有統(tǒng)計學意義（t=3.993、19.502和44.184，P=0.005、0.000和0.000），HCPT誘導A549的細胞自噬可能與m-TOR信號通路有關。見圖3。

圖1 不同濃度HCPT對A549細胞自噬的誘導作用（共聚焦顯微鏡成像×40）

圖2 HCPT對A549細胞自噬相關蛋白LC3表達的影響

圖3 HCPT對A549細胞自噬相關蛋白p-mTOR表達的影響

2.3 HCPT聯(lián)合自噬抑制劑3-MA對肺癌A549細胞的影響

2.3.1 3-MA抑制HCPT誘導的細胞自噬 Western blot檢測各組LC3II/LC3I值的變化，LC3II/LC3I值在200μmol HCPT組、200μmol HCPT+3-MA組、3-MA組及對照組表達為（158.22±3.26）%、（110.30±11.23）%、（107.57±15.86）% 和（100.00±8.02）%，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=37.222，P=0.000），各組LC3II/LC3I值有差別；進一步兩兩比較顯示，3-MA組與對照組比較，LC3II/LC3I值差異無統(tǒng)計學意義（t=0.924，P=0.200），200μmol HCPT組與對照組比較，LC3II/LC3I值差異有統(tǒng)計學意義（t=19.204，P=0.000）；200μmol HCPT+3-MA 組 與200μmol HCPT組比較，LC3II/LC3I值差異有統(tǒng)計學意 義（t=11.243，P=0.000）；200μmol HCPT+3-MA組與3-MA組比較，LC3II/LC3I值差異無統(tǒng)計學意義（t=0.344，P=0.372）。表明自噬抑制劑 3-MA（5 mmol）可以抑制HCPT誘導的自噬。見圖4。

2.3.2 抑制自噬后HCPT對肺癌A549細胞增殖抑制的影響 MTT法測定A549細胞的存活率，自噬抑制劑3-MA聯(lián)合HCPT（50、200和400μmol）處理24 h后，A549細胞的增殖抑制率分別為（30.7±4.3）%、（38.1±4.6）%和（42.9±1.1）%，高于單用HCPT同劑量組的（12.9±2.3）%、（21.6±4.1）% 和（32.7±2.1）%，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=140.801，P=0.000），各組細胞的存活率有差別；進一步兩兩比較顯示，與相同劑量HCPT組比較，50、200和400μmol HCPT+3-MA組中細胞相對存活率差異有統(tǒng)計學意義（t=18.401、15.771和6.476，均P=0.000），這提示HCPT聯(lián)合自噬抑制劑治療肺癌的效果可能更佳。見圖5。

圖4 3-MA（5 mmol）抑制200μmol HCPT誘導的細胞自噬作用

圖5 3-MA抑制自噬后HCPT對肺癌A549細胞增殖抑制的影響

3 討論

無限增殖障礙是惡性腫瘤細胞的一個重要特征。大量藥物的抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞增殖實現(xiàn)的[4-5]。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，HCPT具有抑制A549細胞增殖的作用，且HCPT劑量越大抑制作用越強。這提示HCPT發(fā)揮抗腫瘤的作用可能與其抑制腫瘤細胞增殖有關。

自噬是真核細胞通過溶酶體途徑降解和回收受損的細胞器和大分子物質，維持細胞穩(wěn)態(tài)的過程[6]。一些研究指出[7-8]，自噬可能在癌癥發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用，腫瘤細胞可以通過自噬途徑抵抗由環(huán)境變化所造成的損害，也可以通過自噬啟動程序性死亡通路，發(fā)生自噬性死亡；自噬在不同的腫瘤中所發(fā)揮的作用也是不盡相同的。本研究重點探討了HCPT是否誘導A549細胞發(fā)生自噬。研究結果顯示，經HCPT處理后，A549細胞的LC3II/LC3I比值升高，自噬負性調控蛋白p-mTOR表達降低，結合激光共聚焦熒光染色法觀察結果，可以確定的是，HCPT可誘導A549細胞自噬。有研究指出，肺癌細胞、人宮頸癌HeLa細胞以及結腸癌細胞等均具有較高的自噬潛能，這在其處于惡劣環(huán)境時有一定的保護作用[8-9]。在腫瘤進行化療和放療的過程中，細胞會通過提高自噬活性，快速降解并循環(huán)利用受損的細胞器和大分子物質，及時進行受損DNA的修復，從而抑制腫瘤細胞凋亡，以維持其持續(xù)增殖[8]。另外，自噬也使一些抗腫瘤藥物的作用減弱：替莫唑胺作用于惡性神經膠質瘤細胞3和7 d，細胞中自噬活性先增強后減弱，同時觀察到細胞的增殖先受到抑制后出現(xiàn)增殖現(xiàn)象[10]。有研究表明[8，11]，促進自噬的藥物有抗腫瘤作用，因此靶向促進自噬的藥物在今后的腫瘤治療將會得到重視。目前雷帕霉素作為自噬誘導劑用于腫瘤治療的臨床實驗已經開始，研究證明其具有抑制多種腫瘤細胞的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)[8，12]苦參堿和盼生安分別作用于HepG2細胞和肝癌BEL-7402細胞時均有自噬的參與。這些藥物不僅可以激發(fā)腫瘤細胞的自噬，同時也參與了自噬分子的調控。多種自噬抑制劑可以加強化療藥物的抗腫瘤作用。如抗瘧疾藥物氯喹聯(lián)合化療中的應用，氯喹可以通過改變溶酶體內的酸性環(huán)境進而達到抑制細胞自噬發(fā)生的目的，從而促進化療藥物對腫瘤細胞的殺傷力[8，13]。有研究[8，14]表明曲古抑菌肽（TSA）和伏立諾他（SAHA）發(fā)揮抗腫瘤的作用是通過抑制自噬達到的。此外，有研究表[8，15]明自噬抑制劑如3-MA、渥曼青霉素等多種自噬抑制劑在腫瘤的治療中都有可能扮演重要角色。由此看來，特定情況下細胞自噬具有保護腫瘤細胞的作用，防止其死亡。這提示抑制細胞自噬也可能作為某些腫瘤的治療的途徑。本研究也發(fā)現(xiàn)，HCPT聯(lián)合3-MA比單用HCPT對肺癌A549細胞的增殖抑制作用更強，由此推測HCPT在治療肺癌過程中，聯(lián)合自噬抑制劑可能會使治療效果更佳。

總之，本研究在體外探討了廣譜抗瘤藥物HCPT對肺癌A549細胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)HCPT對A549細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性；HCPT誘導的細胞自噬可能與mTOR信號通路有關；HCPT聯(lián)合自噬抑制劑3-MA發(fā)揮的抗細胞增殖能力更強。其具體機制有待于今后進一步的探討。

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Effect of hydroxycamptothecin on autophagy of A549 lung cancer cells*

Yan-jie Wei1, Zi-he Peng1, Chen-hao Li2, Shuai-lin Hao1, Yuan Zhang1, Zhao-yang Li1,Tong Xiao1, Xiao-hui Hao1, He-liang Liu1, Wei Tian1, Hong-li Wang3
(1. Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063210, China; 2. Department of Oncology, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou,Hebei 061014, China; 3. Public Health School, North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063210, China)

ObjectiveTo investigate whether autophagy is involved in the anticancer mechanisms of hydroxycamptothecin (HCPT) in human lung cancer A549 cellsin vitro.MethodsHuman non-small cell lung cancer cell line A549 was cultured. In our study, cell viability was assessed by MTT assay, Cyto-ID staining was used for autophagy detection which was observed by laser scanning confocal microscope (LSCM), the expression of LC3II/I and p-mTOR were measured by Western blot.ResultsHCPT (50, 200 and 400 μmol) suppressed the viability of A549 cells in a concentration-dependent manner. Moreover, HCPT increased autophagy level in the A549 cells. The autophagy inhibitor 3-MA caused a statistically significant increase in growth inhibition of the HCPT-treated A549 cells.ConclusionsHCPT induces autophagy in lung cancer A549 cellsin vitro. HCPT (50, 200 and 400 μmol) suppresses the viability of A549 cells in a concentration-dependent manner and its induction of cell autophagy is related to the dosage. Autophagy inhibition combined with HCPT may be a better way for the treatment of lung cancer.

lung cancer; autophagy; HCPT; 3-MA; mTOR

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.006

1005-8982（2018）01-0025-05

2017-02-10

河北省高等學校科學技術研究重點項目（No：ZD2017063）；唐山市國際科技合作項目（No：14160201B）；2016年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No：201610081026）；華北理工大學大學生創(chuàng)新實踐計劃項目（No：X2016026）

王宏麗，E-mail：tsruoshui@163.com

R734.2

A

（張蕾 編輯）