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        酶解與包合技術(shù)制備水溶性花粉的比較研究(續(xù))

        2018-01-05 05:45:18劉佳霖殷素會高麗嬌羅文華
        中國蜂業(yè) 2017年12期
        關(guān)鍵詞:蜂花粉果膠酶環(huán)糊精

        劉佳霖 殷素會 高麗嬌 曹 蘭 羅文華 程 尚

        (重慶市畜牧科學(xué)院,榮昌 402460)

        2.4.5 纖維素酶+β-環(huán)糊精:使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.2,加入纖維素酶0.750 g(酶添加量為1500 U/g),65℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7,加入β-環(huán)糊精6.250 g(與蜂花粉質(zhì)量比為1:4),37℃下水浴磁力攪拌4 h,過濾。

        2.4.6 果膠酶+堿性蛋白酶:使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=4.0,加入果膠酶0.469 g(酶添加量為1500 U/g),40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0,加入堿性蛋白酶1.25 g(酶添加量為1500 U/g),50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,過濾。

        2.4.7 果膠酶+β-環(huán)糊精:使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=4.0,加入果膠酶0.4688 g(酶添加量為1500 U/g),40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7,加入β-環(huán)糊精6.250 g(與蜂花粉質(zhì)量比為1∶4),37℃下水浴磁力攪拌4 h,過濾。

        2.4.8 脂酶+堿性蛋白酶:使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5,加入脂酶3.750 g(酶添加量為1500 U/g),40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0,加入堿性蛋白酶1.250 g(酶添加量為1500 U/g),50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,過濾。

        2.4.9 脂酶+β-環(huán)糊精:使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5,加入脂酶3.750 g(酶添加量為1500 U/g),40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7,加入β-環(huán)糊精6.250 g(與蜂花粉質(zhì)量比為1:4),37℃下水浴磁力攪拌4 h,過濾。

        2.4.10 β-葡萄糖苷酶+堿性蛋白酶:使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5,加入葡萄糖苷酶0.189 g(酶添加量為1500 U/g),50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0,加入堿性蛋白酶1.250 g(酶添加量為1500 U/g),50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,過濾。

        2.4.11 β-葡萄糖苷酶+β-環(huán)糊精:使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5,加入葡萄糖苷酶0.189 g(酶添加量為1500 U/g),50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,于100℃下加熱5 min滅酶,冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7,加入β-環(huán)糊精6.250 g(與蜂花粉質(zhì)量比為1:4),37℃下水浴磁力攪拌4 h,過濾。

        2.5 蛋白質(zhì)及黃酮含量測定

        2.5.1 蛋白質(zhì)含量測定:標(biāo)準(zhǔn)曲線測定:采用考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒方法[21],將0、40、80、120、160、200、240 μl牛血清蛋白BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入試管中,加入PBS補(bǔ)足600 μl(600、560、520、480、440、400、360 μl ),向各試管加入11.40 mL考馬斯亮藍(lán)染液,混勻,室溫放置5~10 min,分別在595 nm處記錄吸光值。

        測定蜂花粉水溶液的蛋白質(zhì)含量:取50 ml產(chǎn)物溶液定容至500 ml,將適當(dāng)體積的樣品加入到試管中,并用PBS補(bǔ)足到600 μl,在向各試管加入11.4 ml考馬斯亮藍(lán)染液,混勻,室溫放置5~10 min,分別在595 nm處記錄吸光值。

        按下列公式計(jì)算水溶性蜂花粉的蛋白質(zhì)提取率:水溶性蛋白質(zhì)提取率(%)=

        2.5.2 黃酮含量測定:標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/ml):0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml于10 ml比色管中,加5% NaNO2溶液0.3 ml,搖勻后放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml,搖勻后靜置6 min,加入4%NaOH溶液4 ml在用乙醇或者水定容,搖勻,于波長510 nm處測定吸光度。對所測得的數(shù)據(jù)采用直線回歸法計(jì)算產(chǎn)物黃酮含量

        出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程,并以吸光度為橫坐標(biāo),對照品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]。

        樣品的測定方法:精密吸取1 ml樣品溶液置于10 ml容量瓶中,加入乙醇(加入4 ml)至5 ml,加入NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系[22],搖勻,以相應(yīng)試劑做空白,于510 nm處測定吸光值,并計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

        按下列公式計(jì)算水溶性蜂花粉的黃酮提取率:

        2.6 統(tǒng)計(jì)分析

        采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,方差分析使用One-way ANOVA的LSD法,顯著水平P<0.05。3 結(jié)果與分析

        3.1 蛋白質(zhì)及黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

        以BSA(牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白)為橫坐標(biāo)x(μl),595 nm處吸光值為縱坐標(biāo)y作圖,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0~240 μl BSA范圍內(nèi)符合方程y=0.0038x+0.0373,R2=0.996。

        以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)x(μg),510 nm處吸光值為縱坐標(biāo)y作圖,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0~500 μg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品范圍內(nèi)符合方程y=0.0011x-0.0083,R2=0.999。

        3.2 酶解與包合技術(shù)制備水溶性花粉的比較

        酶解與包合技術(shù)制備水溶性蜂花粉的結(jié)果如表1所示。單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉,水溶性蛋白質(zhì)及黃酮提取率最高的為堿性蛋白酶及環(huán)糊精2:1,水溶性蛋白質(zhì)提取率分別為84.55%和84.33%,黃酮提取率分別為19.51%和18.50%。采用酶解與包合復(fù)合技術(shù)制備水溶性花粉,水溶性蛋白質(zhì)提取率最高的為果膠酶+β-環(huán)糊精和纖維素酶+β-環(huán)糊精,水溶性蛋白質(zhì)提取率分別為95.40%和88.91%;水溶性黃酮提取率最高的為纖維素+堿性蛋白酶和纖維素酶+β-環(huán)糊精,黃酮提取率分別為35.93%和37.86%。綜合比較,采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率,與空白對照相比可提高水溶性蛋白質(zhì)提取率120.95%,提高水溶性黃酮提取率105.98%,顯著高于單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉的效果。

        表1 酶解與包合技術(shù)制備水溶性花粉的比較試驗(yàn)結(jié)果

        4 討論

        蜂花粉是一種天然、綠色、安全的保健品[1,5,6],水溶性、穩(wěn)定性及感官特性是限制其深加工及廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵難題。目前,蜂花粉的深加工通常采用真空冷凍干燥技術(shù)及超微粉碎技術(shù)制備高活性、低致敏的產(chǎn)品,但其理化性狀并沒有得到很大的改善,主要活性成分的提取仍處于發(fā)展階段。酶解改性技術(shù)是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)改性技術(shù),通過多種酶的內(nèi)切或外切作用可以改變物料的理化特性和功能特性,該技術(shù)反應(yīng)速度快、條件溫和、無有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生,能夠保證物料中的活性成分得到有效的保留[23,24]。本研究比較了多種蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、脂酶及葡萄糖苷酶制備水溶性花粉的效果,結(jié)果顯示,不同的酶制備水溶性蜂花粉的效果差異較大,堿性蛋白酶制備的水溶性蜂花粉蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率最高,分別為84.55%和19.51%。與前人的結(jié)果一致[7],堿性蛋白質(zhì)制備水溶性蜂花粉的效果顯著高于其他酶。

        包合技術(shù)是一種重要的蛋白質(zhì)物理改性技術(shù),一般采用環(huán)糊精為輔料,包合物料中的多種小分子物質(zhì),對其營養(yǎng)成分影響較小[25]。該技術(shù)在改善物料水溶性、穩(wěn)定性及感官特性等方面具有十分重要的作用,已廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥等多個產(chǎn)業(yè)[26,27]。本研究比較了不同環(huán)糊精添加量對制備水溶性蜂花粉的影響,結(jié)果顯示,環(huán)糊精添加量對包合技術(shù)制備水溶性蜂花粉的影響較小(P<0.05), 環(huán)糊精2:1制備的水溶性蜂花粉蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率最高,分別為84.33%和18.50%。包合技術(shù)和酶解改性技術(shù)制備水溶性蜂花粉的效果差異不顯著。

        本研究在單一使用酶解與包合技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展蛋白酶+纖維素酶、果膠酶、脂酶、葡萄糖苷酶以及環(huán)糊精+纖維素酶、果膠酶、脂酶、葡萄糖苷酶的復(fù)合工藝制備水溶性蜂花粉的比較研究。綜合結(jié)果顯示,采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉的效果最好,其水溶性蛋白質(zhì)提取率為88.91%,水溶性黃酮提取率高達(dá)37.86%,顯著高于單一酶制劑或環(huán)糊精制備水溶性花粉的效果。由此,本研究認(rèn)為,多種工藝的復(fù)合使用有利于蜂花粉深加工產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展,在改善蜂花粉理化性狀,分離、純化蜂花粉主要活性物質(zhì)方面具有十分廣闊的發(fā)展前景。

        5 結(jié)論

        采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率,與空白對照相比可提高水溶性蛋白質(zhì)提取率120.95%,提高水溶性黃酮提取率105.98%,顯著高于單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉的效果。多種技術(shù)的復(fù)合使用,有助于蜂花粉深加工的進(jìn)一步發(fā)展。

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        3.價格保護(hù)型

        分別受到國家扶貧資金資助、扶持的(產(chǎn)銷一體化)經(jīng)營主體與養(yǎng)蜂合作社、養(yǎng)蜂協(xié)會、養(yǎng)蜂戶之間,有嚴(yán)格的合同契約關(guān)系,由經(jīng)營主體負(fù)責(zé)回收、加工、包裝蜂產(chǎn)品,統(tǒng)一包裝、統(tǒng)一品牌銷售。雙方確定提供蜂產(chǎn)品的數(shù)量、質(zhì)量、價格,不符合質(zhì)量的產(chǎn)品不予收購。價格原則上隨行就市,在保護(hù)價的基礎(chǔ)上可適當(dāng)上下調(diào)整。保護(hù)價的制定應(yīng)考慮到雙方的利益,除保證養(yǎng)蜂戶有基本收益外,也要確保經(jīng)營主體在扣除加工、營銷成本后(如包裝費(fèi)用、加工損耗、檢測費(fèi)用、人工成本、廠房設(shè)備折舊、品牌建設(shè)、市場營銷等),有利可圖,正向運(yùn)轉(zhuǎn)。這種機(jī)制一方面解決了蜂農(nóng)產(chǎn)品賣難的問題,另一方面為企業(yè)建立了可靠的原料基地。

        4.利益均衡型

        當(dāng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展到一定階段,具有一定規(guī)模,經(jīng)營主體具備了較強(qiáng)的實(shí)力后,也可發(fā)展成緊密型“公司+合作社+農(nóng)戶”的生產(chǎn)經(jīng)營模式。經(jīng)營主體除采取制定保護(hù)價等方式保護(hù)農(nóng)戶的利益外,在扣除相應(yīng)的公積金、公益金之后,其銷售環(huán)節(jié)中的部分利益還可按一定比例返還給農(nóng)戶,盡可能均衡公司與農(nóng)戶的利益。

        除了以上幾種單獨(dú)的利益分配機(jī)制外,也可以采取混合經(jīng)營的方式,與不同對象,分別按上述不同的機(jī)制進(jìn)行合作與利益分配。

        貴州省生態(tài)環(huán)境好,大多數(shù)地方蜜粉源植物豐富,在當(dāng)前“大生態(tài)、大健康、大扶貧”的大好形勢下,只要各級地方政府充分認(rèn)識到科學(xué)技術(shù)在養(yǎng)蜂扶貧中的重要作用,認(rèn)真抓好產(chǎn)業(yè)扶貧的組織架構(gòu),著力培育新型經(jīng)營主體,努力提高蜂農(nóng)的組織化程度,處理好各方面的利益聯(lián)結(jié)機(jī)制,養(yǎng)蜂就一定會在扶貧攻堅(jiān)戰(zhàn)中發(fā)揮重要作用,真正實(shí)現(xiàn)“小蜜蜂、大產(chǎn)業(yè)”,通過產(chǎn)業(yè)帶動,使更多的農(nóng)戶達(dá)到脫貧致富奔小康的目的。

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