吳曉暉，謝永麗，Renato D′Ovidio, 張 英，蘆光新，辛總秀, Stefania Masci

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 高原草地資源與生態(tài)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2.意大利Tuscia大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物學(xué)和農(nóng)業(yè)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，意大利 Viterbo 01100)

3株分離自高寒草甸根際芽孢桿菌的分子鑒定及其生物活性

吳曉暉1，謝永麗1，Renato D′Ovidio2, 張 英1，蘆光新1，辛總秀1, Stefania Masci2

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 高原草地資源與生態(tài)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2.意大利Tuscia大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物學(xué)和農(nóng)業(yè)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，意大利 Viterbo 01100)

為青海省退化草地植被恢復(fù)、提高地上生物量篩選優(yōu)良的生防芽孢桿菌菌源,采用16S rDNA及gyrB基因序列分析法，鑒定分離自青海省黃南州高寒草甸高山嵩草(Kobresiapygmaea)根圍的3株芽孢桿菌菌株；平板對(duì)峙試驗(yàn)檢測(cè)菌株拮抗病原真菌活性；菌懸液(細(xì)胞濃度為106cfu·mL-1)浸種以檢測(cè)菌株對(duì)植物催芽及促生效果；CMC、Gram染色法及DNS法檢測(cè)菌株降解纖維素活性，并擴(kuò)增菌株降解纖維素酶編碼基因。結(jié)果表明,菌株HNC3被鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus),菌株HNC8、HNC11被鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；3株菌株對(duì)小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、瓜類(lèi)枯萎病菌(Fusariumoxysporum)具有明顯的拮抗活性(抑菌圈平均直徑均≥11 mm)；3株菌株對(duì)小麥(Triticumaestivum)種子具有明顯的催芽及促生效果；小麥種子經(jīng)菌株HNC3菌懸液處理后，芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)增加率分別達(dá)55%、80%；菌株HNC3降解纖維素酶活高達(dá)367.51 U·mL-1，并在該菌株中擴(kuò)增到地衣聚糖酶(Lichenase，blg1S)、甘露糖苷酶(mannosidase，ManSig)、木聚糖酶(xylanase，xynD、xynB)4個(gè)纖維素酶編碼基因。分離自青藏高原高寒草甸根圍的3株芽孢桿菌兼具拮抗、催芽、促生及降解纖維素活性，在高原草地植被恢復(fù)、生態(tài)農(nóng)牧業(yè)中具有一定的研究及應(yīng)用潛力。

高寒草甸；生防芽孢桿菌；分子鑒定；催芽促生

高寒草甸是青藏高原典型生境，是三江源區(qū)主要草地類(lèi)型。青藏高原海拔高、溫度低、紫外線強(qiáng)，特殊生境使高寒牧草普遍生長(zhǎng)緩慢[1]。近年來(lái)，由于鼠蟲(chóng)危害、過(guò)度放牧、對(duì)草地缺乏科學(xué)管理等因素，致使優(yōu)良牧草退化，滋生了大量毒雜草，高寒草甸草皮剝落嚴(yán)重，土壤裸露，生態(tài)環(huán)境日益惡化，草地退化為“黑土灘”[2]。大面積“黑土灘”退化草地的形成影響了該地區(qū)牧民和家畜的生存發(fā)展，也威脅著三江源中下游地區(qū)的生態(tài)平衡[3]。因此，加速牧草生長(zhǎng)、恢復(fù)生態(tài)植被、提高草地生物量，在高原草地生態(tài)環(huán)境恢復(fù)及治理中尤為重要。

草地土壤微生物推動(dòng)著草地生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，維持著草地生態(tài)系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，是草業(yè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。芽孢桿菌(Bacillus)是一類(lèi)重要的植物根圍促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，生理特征豐富多樣，能產(chǎn)生對(duì)紫外線、干旱、低溫、鹽堿等逆境有抗性的芽孢，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品加工、環(huán)保、醫(yī)藥等多個(gè)方面[5]。部分芽孢桿菌可通過(guò)多途徑促生機(jī)制的相互作用提高植物抗病性，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。芽孢桿菌可通過(guò)定殖在植物根際、體表及體內(nèi)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)植物周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)，分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)根圍營(yíng)養(yǎng)和根部侵染空間位點(diǎn)、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng)和擴(kuò)展或激發(fā)植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，從而達(dá)到使植物抵御病原菌侵染的目的，使芽孢桿菌在植物病害生物防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[6]。芽孢桿菌在生命活動(dòng)中的代謝產(chǎn)物對(duì)于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、改善植物營(yíng)養(yǎng)狀況有良好的作用，這對(duì)于草地植被恢復(fù)和草地生物量的提高有重要的意義，是具有應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥和生物菌肥的研發(fā)菌源[7]。此外，相關(guān)報(bào)道也證實(shí)部分芽孢桿菌可以產(chǎn)生胞外纖維素酶、半纖維素酶、內(nèi)切木聚糖酶等，可以有效降解木質(zhì)纖維素[8]。若將可產(chǎn)生降解木質(zhì)纖維素酶類(lèi)的生防芽孢桿菌應(yīng)用于秸稈還田，可通過(guò)其分泌的纖維素降解酶來(lái)降解草料及秸稈中的木質(zhì)纖維素，有效地釋放養(yǎng)分[9]。同時(shí)，秸稈還田會(huì)將秸稈中的大量及微量元素釋放到土壤中，能有效改善土壤物理性狀，增加土壤養(yǎng)分含量，有利于土壤中有機(jī)質(zhì)的積累[10]。

近年來(lái),隨著核酸技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA和gyrB基因常被用于細(xì)菌鑒定。核糖體16S rDNA基因序列全長(zhǎng)約1 550 bp，由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成，利用保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，該引物幾乎能與所有種屬的核糖靶位點(diǎn)結(jié)合，但16S rDNA分子內(nèi)的變異程度并不能區(qū)分親緣關(guān)系十分接近的細(xì)菌[11]。gyrB即促旋酶(gyrase)的B亞單位基因，屬信息通路中與DNA復(fù)制、限制、修飾或修復(fù)有關(guān)的蛋白編碼基因。由于其固有的遺傳密碼子兼并性使得DNA序列可發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，使gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細(xì)菌近緣種方面，比非蛋白編碼基因16S rDNA具有更高的分辨率[12]。

本研究以分離自青海省黃南州高寒草甸高山嵩草(Kobresiapygmaea)根圍的芽孢桿菌為供試菌株，通過(guò)16S rDNA及gyrB基因序列分析鑒定菌株；通過(guò)平板對(duì)峙法檢測(cè)菌株拮抗活性；測(cè)定菌株對(duì)高原植物的催芽及促生效用；并測(cè)定菌株降解纖維素的活性，對(duì)菌株可產(chǎn)生的解纖維素酶進(jìn)行基因擴(kuò)增及序列分析；以期為高原草地植被恢復(fù)、治理“黑土灘”及生態(tài)畜牧業(yè)提供適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境的生物菌肥和生物農(nóng)藥的研發(fā)菌源。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)簡(jiǎn)介

青海省黃南州地勢(shì)南高北低，海拔在3 500 m以上，屬高原大陸性氣候，熱量不足，無(wú)霜期短，降水變率大，時(shí)空分布不均；光照時(shí)間長(zhǎng)，太陽(yáng)輻射強(qiáng)；冷季漫長(zhǎng)干冷，氣候環(huán)境獨(dú)特，因此孕育著豐富而獨(dú)特的低溫微生物資源[13]。

1.2 試驗(yàn)材料及供試菌株

病原指示菌：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、瓜類(lèi)枯萎病菌(Fusariumoxysporum)由青海大學(xué)高原草地資源與生態(tài)省部共建實(shí)驗(yàn)室保存。

小麥(Triticumaestivum)種子(品種為青春38號(hào)、紅禿頭)由青海省農(nóng)林科學(xué)院饋贈(zèng)。

細(xì)菌培養(yǎng)基：LB(Luria-Bertani) 培養(yǎng)基參考謝永麗和高學(xué)文[14]方法配制，真菌培養(yǎng)(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基參考李振東等[15]方法配制，CMC-Na培養(yǎng)基配制參考張霞等[16]方法配制。引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 芽孢桿菌分子鑒定

1.3.116S rDNA基因序列分析 通過(guò)16S rDNA基因序列分析鑒定菌株，以菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA基因，正向引物127F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物1492R:5′-GCYTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)[17]。

1.3.2gyrB基因序列分析 通過(guò)gyrB基因序列分析鑒定菌株，以菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增gyrB基因，正向引物gyrB-For：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，反向引物gyrB-Rev：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。將gyrB擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)[18]。

1.4 拮抗病原真菌活性測(cè)定

分別將在26 ℃培養(yǎng)箱中活化好的小麥赤霉病菌、瓜類(lèi)枯萎病菌PDA平板邊緣選取直徑為0.7 cm的菌碟, 接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5 cm處，呈“十”字形分布的4個(gè)接種點(diǎn)，放置直徑4 mm濾紙小圓片，37 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)14 h后，吸取5 μL菌液，接種于濾紙片，每個(gè)處理重復(fù)3次，放入26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，取出觀測(cè)并記錄抑菌結(jié)果[17]。

1.5 芽孢桿菌促生特性

1.5.1促種子萌發(fā) 選擇種皮完好的小麥種子在20%次氯酸鈉溶液中消毒處理20 min，用無(wú)菌水沖洗3～4次，去除種子表面殘留的次氯酸鈉；將植物種子在芽孢桿菌菌懸液中浸種24 h(菌懸液稀釋濃度106cfu·mL-1)，無(wú)菌水處理作對(duì)照；將浸種后的種子播于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28 ℃，光周期16 h/8 h)，培養(yǎng)5 d后測(cè)定種子的萌發(fā)情況，測(cè)定芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)芽孢桿菌對(duì)植物的催芽效果；每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選50粒種子進(jìn)行測(cè)定和記錄[18]。

1.5.2促幼苗生長(zhǎng) 選擇種皮完好的小麥種子在20%次氯酸鈉溶液中消毒處理20 min，消毒后用無(wú)菌水沖洗3～4次；將小麥種子先用無(wú)菌水浸種24 h后，以芽孢桿菌菌懸液(菌懸液稀釋濃度106cfu·mL-1)浸種24 h，無(wú)菌水處理作對(duì)照；用濕潤(rùn)濾紙吸干植物種子表面多余的水分，將植物種子包裹于15 cm定性濾紙中，每張濾紙包裹8枚種子，濾紙卷豎直放入盛有水的塑料杯子中，水面不超過(guò)種子所在位置，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28 ℃，光周期16 h/8 h)；培養(yǎng)10 d后調(diào)查幼苗株高和根長(zhǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)以8株幼苗為測(cè)定單位，統(tǒng)計(jì)芽孢桿菌對(duì)植物的促生效果[18]。

之所以說(shuō)眼前的一銨市場(chǎng)，暗流涌動(dòng)，自我感覺(jué)是這樣的：一是各大港口硫磺價(jià)格開(kāi)始上漲，幅度還相當(dāng)可觀，廠家要看成本的呀！二是磷銨廠家?guī)齑嫫毡楹艿停惚M管觀望，我們耗得起。三是秋高氣爽時(shí)，誰(shuí)還不找個(gè)新話題，冬儲(chǔ)可以提前拿上日程表來(lái)聊聊。四是作為磷復(fù)肥行業(yè)的盛會(huì)，“2018中國(guó)磷復(fù)肥工業(yè)展覽會(huì)暨第十九屆國(guó)產(chǎn)高濃度磷復(fù)肥產(chǎn)銷(xiāo)會(huì)”將于11月9-11日在浙江寧波召開(kāi)，終歸有點(diǎn)表現(xiàn)吧，至于市場(chǎng)認(rèn)不認(rèn)賬，那是另外一回事，每年感覺(jué)都有這么似曾相識(shí)的一幕。五是……不說(shuō)了，托您的福，雅您的思，磷酸一銨市場(chǎng)，暗流涌動(dòng)，我們大家都Get到了。

1.6 降解纖維素活性測(cè)定

在CMC-Na篩選培養(yǎng)基平板上，呈“十”字形分布的4個(gè)接種點(diǎn)，放置直徑4 mm濾紙小圓片。將供試菌株在 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h后，取待測(cè)菌液5 μL點(diǎn)于濾紙片中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，將革蘭氏碘染液(Gram Iodime)注入并淹沒(méi)平板表面，蓋上平皿蓋，靜置4 min后，倒去染液，觀測(cè)并記錄試驗(yàn)結(jié)果。測(cè)定并記錄透明圈直徑和菌落直徑，并計(jì)算二者比值A(chǔ)[15]。

1.7 解纖維素酶類(lèi)編碼基因分析

根據(jù)已報(bào)道的芽孢桿菌所編碼的纖維素酶編碼基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增菌株HCN3的纖維素酶編碼基因，引物序列如表1所列。

表1 纖維素酶編碼基因擴(kuò)增引物Table 1 Oligo DNA primers used for cellulose coding genes amplifying

PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.8 胞外酶酶活測(cè)定

將芽孢桿菌菌液以2%的接菌量轉(zhuǎn)接至CMC誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h；將培養(yǎng)液在4 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，上清液即視為粗酶液。取滅菌2 mL離心管，分別加入200 μL 1%的CMC-Na(溶于pH 7.0 PBS)作為反應(yīng)底物(測(cè)定各菌株的胞外內(nèi)切纖維素酶活)。將各反應(yīng)底物在37 ℃金屬浴中保溫，吸取200 μL上述稀釋至合適濃度的粗酶液分別與不同底物渦旋混合，于37 ℃金屬浴上精確反應(yīng)30 min；取出后立即加入500 μL DNS試劑終止反應(yīng)，并于沸水中煮沸5 min，冷卻后，加入1 mL ddH2O；將反應(yīng)液移至紫光分光分度計(jì)中測(cè)定OD540；按照繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出反應(yīng)液中對(duì)應(yīng)還原糖的含量，根據(jù)酶活公式，計(jì)算得出各菌株的兩種酶活力。以每分鐘催化生成1 μmol還原糖作為1個(gè)酶活單位，記作1 U。每個(gè)樣品測(cè)定5次，取平均值[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA序列分析鑒定

以菌株HNC3、HNC8、HNC11基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA基因，擴(kuò)增到大小約1 500 bp的PCR特征性條帶，與芽孢桿菌16S rDNA的理論值基本相符。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上與GenBank中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明：菌株HNC3與Bacillussp.序列(登錄號(hào)：GQ199764.1)相同(或一致)性為98%；菌株HNC8與B.thuringiensisL14(登錄號(hào)：KU179330.1)的16S rDNA序列相同(或一致)性為99%；菌株HNC11與B.thuringiensisZLynn500-22 (登錄號(hào)：KY316414.1)的16S rDNA序列相同(或一致)性為99%(表2)。

2.2 gyrB序列分析鑒定

以菌株HNC3、HNC8、HNC11基因組DNA為模板擴(kuò)增gyrB基因，擴(kuò)增到大小約1 300 bp的PCR特征性條帶，與芽孢桿菌gyrB的理論值基本相符。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上與GenBank中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明：菌株HNC3與B.pumilusATCC27142(登錄號(hào)：AY167870.1)的gyrB序列相同(或一致)性為98%；菌株HNC8與B.thuringiensisHD12(登錄號(hào)：CP014847.1)的gyrB序列相同(或一致)性為93%；菌株HNC11與B.thuringiensisHD1002(登錄號(hào)：CP009351.1)的gyrB序列相同(或一致)性為94%(表2)。

表2 分離菌株的16S rDNA及gyrB序列比對(duì)結(jié)果Table 2 List of isolates closest affiliation of 16S rDNA and gyrB gene sequencing

根據(jù)16S rDNA、gyrB基因序列比對(duì)分析結(jié)果，將菌株HNC3鑒定為短小芽孢桿菌B.pumilus，菌株HNC8、HNC11鑒定為蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis。

2.3 拮抗病原真菌活性

通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)檢測(cè)菌株拮抗活性，結(jié)果顯示，菌株HNC3、HNC8、HNC11均對(duì)植物病原真菌小麥赤霉病菌、瓜類(lèi)枯萎病菌具有較強(qiáng)的拮抗效果，抑菌圈平均直徑均≥11 mm，表現(xiàn)明顯的抑真菌效果(圖1，表3)。

圖1 拮抗病原真菌活性Fig. 1 Antagonistic activity to pathogenic fungi

2.4 芽孢桿菌促生特性

2.4.1促種子萌發(fā) 將不同品種小麥種子在菌株菌

懸液中浸種24 h(菌懸液濃度106cfu·mL-1)，培養(yǎng)5 d后測(cè)定種子萌發(fā)效果。結(jié)果表明，菌株HNC3、HNC8、HNC11菌懸液處理小麥種子，萌發(fā)效率明顯提高，與無(wú)菌水相比，種子萌發(fā)后芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)均有增加；其中，菌株HNC8對(duì)紅禿頭小麥品種的根長(zhǎng)具有顯著的促生長(zhǎng)作用(P<0.05)，經(jīng)處理的小麥種子萌發(fā)后，平均根長(zhǎng)達(dá)到14.02 cm，與對(duì)照相比提高了31%；菌株HNC3對(duì)青春38號(hào)小麥根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)具有顯著的促生長(zhǎng)作用(P<0.05)，經(jīng)處理的小麥種子萌發(fā)后，平均芽長(zhǎng)達(dá)到14.21 cm，與對(duì)照相比增加55%；平均根長(zhǎng)達(dá)到13.90 cm，與對(duì)照相比增加80%(圖2、表4)。

2.4.2促幼苗生長(zhǎng) 將不同品種小麥種子經(jīng)芽孢桿菌菌懸液浸種24 h(菌懸液濃度106cfu·mL-1)，培養(yǎng)10 d后，測(cè)定生防芽孢桿菌對(duì)小麥幼苗的促生效果。結(jié)果表明，3株供試菌株菌懸液對(duì)小麥幼苗均有不同程度的促生效果。其中，菌株HNC3對(duì)紅禿頭小麥幼苗的促生長(zhǎng)作用尤為顯著(P<0.05)，經(jīng)處理的小麥幼苗的平均株高達(dá)到18.36 cm，與對(duì)照相比增加了72%，平均根長(zhǎng)達(dá)到6.90 cm，與對(duì)照組相比增加了50%(圖3、表5)；HNC11對(duì)青春38號(hào)小麥的促生長(zhǎng)作用顯著，經(jīng)處理的小麥幼苗平均株高達(dá)到12.63 cm，與對(duì)照相比增加了45%,平均根長(zhǎng)達(dá)到6.83 cm，與對(duì)照相比增加了63%(圖3、表5)。

表3 芽孢桿菌拮抗病原真菌活性Table 3 Antagonistic activity to pathogenic fungi

注：+,抑菌圈半徑0-5 mm；++,抑菌圈直徑5-10 mm；+++,抑菌圈直徑10-15 mm；++++,抑菌圈直徑>15 mm。

Note：+， Inhibition zone radius 0-5 mm; ++， Inhibition zone radius 5-10 mm; +++， Inhibition zone radius 10-15 mm; ++++， Inhibition zone radius≥15 mm.

2.5 降解纖維素活性測(cè)定

將菌株在CMC-Na培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后用Gram染液染色，測(cè)其透明圈的直徑，結(jié)果顯示(圖4，表6)：3株菌株所產(chǎn)生的透明圈直徑分別為16、19和19 mm；D/d比值分別為3.20、3.80和3.80，降解纖維素的活性與透明圈直徑D和菌落直徑d之比呈正相關(guān)關(guān)系，即D/d值越大，菌株解纖維素活性越強(qiáng)。

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液中所含葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活性大小。結(jié)果顯示，菌株HNC3的酶活在3株菌株中最高，達(dá)到367.51 U·mL-1，3株菌株酶活均在290～370 U·mL-1，具有較高的產(chǎn)酶能力(表6)。

2.6 纖維素酶編碼基因擴(kuò)增分析

以供試菌株HNC3基因組 DNA 為模板，以引物xynB、xynD擴(kuò)增木聚糖酶編碼基因，擴(kuò)增到大小為1 183 bp的 PCR 特征性條帶，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，菌株HNC3中克隆到木聚糖酶(xylanase)編碼基因；以引物blg1S擴(kuò)增地衣聚糖酶編碼基因，擴(kuò)增到大小約為720 bp的PCR 特征性條帶，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示成功克隆到地衣聚糖酶(lichenase)編碼基因；以引物ManSig擴(kuò)增甘露糖苷酶編碼基因，擴(kuò)增到大小約為1 000 bp的PCR 特征性條帶，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示成功克隆到甘露糖苷酶(mannosidase)編碼基因(圖5)。

圖2 芽孢桿菌促小麥種子萌發(fā) Fig. 2 Germination-promoting activity of Bacillus suspension on wheat plant seeds

表4 芽孢桿菌促植物種子萌發(fā)Table 4 Germination-promoting activity of plant seed induced by Bacillus spp.

注：同列不同字母表示在0.05水平上有顯著差異(P<0.05)。表5同。

Note：Different lower letters within the same column indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level; similarly for Table 5.

3 討論與結(jié)論

青藏高原特殊生境為生物多樣性提供了棲息環(huán)境，孕育了特殊多樣的微生物資源，芽孢桿菌以其獨(dú)特生物學(xué)特性，在農(nóng)牧業(yè)發(fā)展中有著廣闊應(yīng)用潛力?！叭≈诟咴弥诟咴?，是符合生態(tài)理念研究及資源開(kāi)發(fā)的應(yīng)用途徑。芽孢桿菌在多種極端環(huán)境中，適應(yīng)性強(qiáng)、定殖速度快，有促生、抗病等生物學(xué)特性，對(duì)于高寒草地退化及農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)具有重要的研究及應(yīng)用價(jià)值[14]。芽孢桿菌通過(guò)多途徑促生機(jī)制的相互作用提高植物抗病性，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)，其促生機(jī)制復(fù)雜多樣。直接促生作用為自身產(chǎn)生植物生長(zhǎng)相關(guān)激素：赤霉素、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等[15]；產(chǎn)生揮發(fā)性化合物(volatiles)：2,3-丁二酮等物質(zhì)直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)；產(chǎn)生植酸酶、嗜鐵素等促進(jìn)植物對(duì)難溶性磷、鐵等元素的吸收，從而提高植物根際養(yǎng)分的可利用性而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[15]；如,解淀粉芽孢桿菌FZB24可產(chǎn)生肌醇六磷酸酶(phytase)，能降解肌醇六磷酸，形成的可溶性磷能被植物吸收利用。間接促生作用包括刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)或直接抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，降低植物病害的發(fā)生，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16]。

圖3 芽孢桿菌促小麥幼苗生長(zhǎng)Fig. 3 Growth-promoting effect of Bacillus suspension on wheat seeding

表5 芽孢桿菌促小麥幼苗生長(zhǎng)效率Table 5 Effect of promotion by Bacillus spp. on plant seedlings

圖4 芽孢桿菌降解纖維素活性 Fig. 4 Cellulose-degrading activity test of Bacillus strains

圖5 纖維素酶編碼基因擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 The amplification results of different cellulose enzyme-coding genes

本研究以分離篩選自青海省黃南州高寒草甸根圍的芽孢桿菌HNC3、HNC8、HNC11為供試菌株，以16S rDNA和gyrB基因序列分析將菌株HNC3鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、菌株HNC8、HNC11鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；gyrB基因是16S rDNA基因以外適合細(xì)菌鑒別的又一理想靶基因，gyrB基因編碼DNA解旋酶B亞單位，其基因進(jìn)化率快，堿基替換頻率高，在相似細(xì)菌的檢測(cè)和鑒別方面比16S rDNA基因更具優(yōu)越性和準(zhǔn)確性[12]。芽孢桿菌對(duì)植物病原菌的拮抗作用表現(xiàn)在刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)或通過(guò)非核糖體肽途徑產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，如,表面活性素(surfactin)、桿菌素D(bacillomycins D)和泛革素(fengycin)等，直接抑制植物病原菌生長(zhǎng)，降低植物病害的發(fā)生[20-21]。本研究以小麥赤霉病菌、瓜類(lèi)枯萎病菌為病原指示菌，測(cè)定菌株HNC3、HNC8、HNC11對(duì)病原真菌的拮抗活性，3株菌株所形成的抑菌圈平均直徑均≥11 mm，均表現(xiàn)顯著的抑病原真菌效果。以菌株菌懸液(菌懸液濃度106cfu·mL-1)對(duì)小麥種子浸種后的試驗(yàn)結(jié)果表明，菌懸液處理后的小麥種子萌發(fā)效率明顯提高，其中菌株HNC3促生效果最為顯著，與無(wú)菌水對(duì)照相比，青春38號(hào)小麥芽長(zhǎng)增加率為55%，根長(zhǎng)增加率為80%；以菌株菌懸液(菌懸液濃度106cfu·mL-1)對(duì)小麥種子浸種后對(duì)幼苗促生效果的試驗(yàn)結(jié)果表明：小麥幼苗株高顯著提高，其中，紅禿頭小麥幼苗與對(duì)照組相比株高增加率為72%、根長(zhǎng)增加率為50%。分離自黃南州高寒草甸的幾株芽孢桿菌兼具對(duì)植物的促生、催芽作用及對(duì)病原菌的拮抗活性，適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境，可作為促進(jìn)牧草生長(zhǎng)，提高草地地上生物量的生物菌肥的研發(fā)菌源，在退化草地恢復(fù)及生態(tài)農(nóng)業(yè)中具有應(yīng)用潛力。

青海省為重要的農(nóng)牧業(yè)大省，畜牧業(yè)發(fā)展極為重要。在青貯飼料加工過(guò)程中，添加纖維素酶制劑，通過(guò)纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁的分解，不僅可為青貯發(fā)酵提供充足的糖源，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，而且可降低青貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，提高青貯飼料的消化率。此外，纖維素酶能夠轉(zhuǎn)化玉米芯、稻草、秸稈等粗飼料，把其中的一部分纖維素轉(zhuǎn)化為糖、菌體蛋白、脂肪等，降低飼料中粗纖維含量，提高粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，擴(kuò)大飼料來(lái)源[22-23]。本研究通過(guò)CMC平板篩選及Gram染色法測(cè)定菌株HNC3、HNC8、HNC11的解纖維素活性，結(jié)果表明，3株菌株所產(chǎn)生的降解透明圈直徑分別為16、19和19 mm，D/d比值分別為3.20、3.80和3.80，表現(xiàn)出顯著的降解纖維素的活性；對(duì)菌株HNC3可產(chǎn)生的纖維素酶編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增分析，擴(kuò)增到地衣聚糖酶基因(blg1S)、甘露糖苷酶基因(ManSig)、木聚糖酶基因(xynB、xynD)，表明菌株HNC3可產(chǎn)生多種纖維素降解酶，在飼料加工或秸稈還田中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。如果利用可產(chǎn)生降解纖維素酶類(lèi)的生防芽孢桿菌，應(yīng)用于作物秸稈還田，對(duì)于農(nóng)田土壤結(jié)構(gòu)和肥力的改善有重要的意義。

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MolecularidentificationandbiologicalactivityofthreeBacillusstrainsisolatedfromanalpinemeadowrhizosphereinQinghaiProvince

Wu Xiao-hui1, Xie Yong-li1, Renato D′Ovidio2, Zhang Ying1, Lu Guang-xin1, Xin Zong-xiu1, Stefania Masci2

(1.College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Key Laboratory of Altiplaino Grassland Resource and Ecology Ministry, Xining 810016, Qinghai, China; 2. Faculty of Agriculture, University of Tuscia, Laboratory of Agricultural Biology and Agricultural Chemistry, Viterbo 01100, Italy)

For the purpose of restoring degraded vegetation and improving the aboveground biomass of grassland, the biological activity of three strains ofBacillusspp. bio-control agents were isolated and screened. Three strains isolated from an alpine meadow (Kobresiapygmaea) rhizosphere in Huangnan Autonomous Prefecture, Qinghai Province, were identified by 16S rDNA andgyrBpartial sequence analyses. Antagonistic activity of strains to pathogenic fungi were determined by the flat confrontation test, and the growth-promoting activities of strains were checked by soaking plant seeds in strain suspension (106cfu·mL-1of cell concentration). In addition, cellulose-degrading activities of strains were checked with carboxymethylcellulose (CMC) plate test, Gram staining, and 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) methods; moreover, cellulase coding genes of the strains were amplified and analyzed. The results showed that the isolate of HNC3 was identified asBacilluspumilus, and isolates of HNC8 and HNC11 were identified asB.thuringiensis. The three strains presented distinct antagonistic activity toFusariumgraminearumS andFusariumoxysporum(inhibition zone diameter ≥ 11 mm). Furthermore, the strains showed obvious germination and growth-promoting activity after soaking the wheat seeds inBacillussuspension. The effect of the isolate of HNC3 on the growth of wheat seedlings was significant; the rate of bud and root length growth increased by 55% and 80%, respectively. The cellulase activity of the isolate of HNC3 reached 367.51 U·mL-1, and its cellulase coding genes could be amplified including lichenase (blg1S), mannosidase (ManSig), and xylanase (xynD,xynB). The threeBacillusstrains used as bio-control agents all showed antagonistic, plant growth-promoting, and cellulose-degrading activities, which present future research opportunities into the potential of their application in the recovery of plateau grassland vegetation, as well as in the field of ecological animal husbandry.

alpine meadow;Bacillusbio-control agent; molecular identification; plant growth promotion

Xie Yong-li E-mail:986237342@qq.com

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S812.29;S182

A

1001-0629(2017)12-2454-10

2017-02-06接受日期2017-09-14

青海省科技廳應(yīng)用(基礎(chǔ))研究項(xiàng)目(2015-ZJ-732)；青海省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(2013-H-805)； 國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31660543)

吳曉暉(1994-)，女，青海西寧人，在讀碩士生，研究方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)。E-mail:377890164@qq.com

謝永麗(1971-)，女，青海西寧人，副教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)。E-mail:986237342@qq.com

(責(zé)任編輯 王芳)