黃郁蔥 丁 燏 梁秀全 蔡雙虎 吳灶和, 簡(jiǎn)紀(jì)常①

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088; 2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湛江 524088;3. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣州 510225; 4. 廣東省湛江市霞山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 湛江 524000)

CD4分子是 T淋巴細(xì)胞重要的表面標(biāo)志分子之一, 作為 T細(xì)胞輔助受體參與抗原識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),同時(shí)還具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能, 在介導(dǎo)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要作用。哺乳類 CD4分子為單鏈跨膜糖蛋白, 屬于免疫球蛋白超家族成員, 主要表達(dá)于Th細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞及某些B細(xì)胞、EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞表面、樹突狀細(xì)胞和腦細(xì)胞膜(Parnes, 1989)。哺乳類CD4由信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成, 胞外區(qū)包含4個(gè)IgSF結(jié)構(gòu)域(D1—D4), 其中D1和D3結(jié)構(gòu)域?yàn)閂樣結(jié)構(gòu)域, D2和D4為C樣結(jié)構(gòu)域。在抗原識(shí)別過(guò)程中, CD4分子的D1和D2結(jié)構(gòu)域可與MHC II類分子非多肽區(qū)結(jié)合(Parnes, 1989), 有助于增強(qiáng) TCR與抗原肽-MHCII 復(fù)合物之間的相互作用并輔助 TCR識(shí)別抗原。胞內(nèi)區(qū)的CXCP基序是Src家族成員酪氨酸蛋白激酶p56lck的結(jié)合部位, 參與T細(xì)胞活化、增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Smith-Garvinet al, 2009)。CD4分子也是人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)受體, 其D1結(jié)構(gòu)域可與HIV gp120結(jié)合。此外,CD4還是T細(xì)胞IL-16的受體, 可調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的增殖和趨化(Lynchet al, 2003)。

2004年, Suetake等(2004)首先報(bào)道了紅鰭東方(Takifugu rubripes)的 CD4分子, 繼而多種魚類的CD4分子先后得到克隆鑒定(Lainget al, 2006;Buonocoreet al, 2008; Patelet al, 2009; Katoet al,2013)。研究發(fā)現(xiàn)此類魚類CD4分子胞外區(qū)大多含有典型的4個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域。此外, 在還發(fā)現(xiàn)另一種魚類特有的CD4分子, 該CD4分子胞外區(qū)僅含兩個(gè)或三個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域, 命名為CD4REL或CD4-2 (Dijkstraet al, 2006; Lainget al, 2006; Edholmet al, 2007;?verg?rdet al, 2010)。CD4-2分子與 CD4分子在染色體上呈線性排列, 分布在 GAPDH、LPREL2和TAPBP-R之間。CD4分子和CD4-2分子在結(jié)構(gòu)上有很多的相似之處, 如CD4和CD4-2分子胞內(nèi)區(qū)雖然都含有與p56lck結(jié)合基序, 但魚類 CD4和 CD4-2分子在一些重要結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)模式存在差異, 因此兩者的功能可能并不相同。此外, 有關(guān)CD4和CD4-2在抗菌免疫中的作用及其免疫調(diào)節(jié)功能仍有待進(jìn)一步研究加以闡明。

紅笛鯛(Lutianus sanguineus)是我國(guó)南方沿海網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖重要海水養(yǎng)殖魚類之一, 然而近年來(lái)細(xì)菌病和寄生蟲病頻繁暴發(fā), 嚴(yán)重制約了其養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展(Zhanget al, 2011)。提高機(jī)體免疫力是魚病防治的基礎(chǔ), 探求其免疫防御機(jī)制對(duì)于魚病防治具有重要的指導(dǎo)意義。然而, 到目前為止尚未有紅笛鯛T細(xì)胞表面標(biāo)志基因的報(bào)道。本研究克隆了紅笛鯛CD4和CD4-2的cDNA全長(zhǎng)序列, 應(yīng)用熒光定量PCR (Real Time Quantitative PCR, qPCR)檢測(cè)了CD4和CD4-2在健康魚組織中的分布和哈維氏弧菌疫苗誘導(dǎo)后紅笛鯛免疫相關(guān)組織中的表達(dá)變化, 為進(jìn)一步研究紅笛鯛T細(xì)胞免疫功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

健康紅笛鯛購(gòu)自湛江南三島某海水養(yǎng)基地, 體質(zhì)量約 100g/尾, 活力好, 攝食正常, 暫養(yǎng)于水溫25—28°C的海水養(yǎng)殖試驗(yàn)水泥池中, 24h連續(xù)充氧,每天早晚投喂商品配合飼料各一次, 日換水量三分之一。暫養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 哈維氏弧菌疫苗的免疫及樣品采集

將哈維氏弧菌強(qiáng)毒株 ZJ0603接種于 TSB (2%NaCl)培養(yǎng)基中, 28°C振蕩培養(yǎng)12h, 用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌液濃度, 剩余菌液緩慢加入0.3%福爾馬林, 28°C滅活24h, 滅活完全后將哈維氏弧菌疫苗菌液用PBS(0.01mol/L, pH 7.4)調(diào)整濃度為 1×109CFU/mL, 置2—8°C保存?zhèn)溆?。將?shí)驗(yàn)魚分成2組, 免疫組每尾魚腹腔注射哈維氏弧菌疫苗菌液0.2mL, 對(duì)照組注射等量無(wú)菌 PBS, 于免疫后的 4、8、12、24、48和 72h分別采集胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、鰓、皮膚、后腎和腸 8個(gè)組織, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集 5尾紅笛鯛, 置于RNAlater –80°C保存?zhèn)溆? 收集的組織主要用于熒光定量分析。同時(shí)取5尾健康魚的胸腺、鰓、頭腎、肝、脾、中腎、心臟、腸、腦、胃、皮膚和肌肉組織立即置液氮中, 用于cDNA全長(zhǎng)克隆和組織表達(dá)分析。

1.3 頭腎淋巴細(xì)胞的制備及體外刺激試驗(yàn)

分別取5尾健康紅笛鯛用MS-222麻醉后, 75%酒精短暫全身浸泡消毒, 無(wú)菌條件下取出頭腎組織,迅速置于RPMI1640(含100U青霉素, 100μg/mL鏈霉素和 0.5%胎牛血清), 用無(wú)菌的剪刀將其剪成小塊后置于100目的無(wú)菌細(xì)胞篩網(wǎng)上, 用一次性無(wú)菌的注射器頭輕輕研磨頭腎組織, 用RPMI1640沖洗篩網(wǎng), 去掉細(xì)胞碎片, 獲取頭腎細(xì)胞懸液備用。用無(wú)菌槍頭吸取2 mL頭腎細(xì)胞懸液沿管壁小心緩慢地加到等34%和 51%不連續(xù)密度梯度Percoll細(xì)胞分離液界面上。于4°C、500g離心30min, 小心吸取兩層Percoll細(xì)胞分離液中間層白細(xì)胞, 用RPMI1640洗滌2次, 再用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù), 調(diào)整所收集到的細(xì)胞懸液濃度為 5.0×105, 以每孔接種 1mL接種到 24孔板中,25°C培養(yǎng) 4h, 收集細(xì)胞懸液后, 重新接種到新的 24孔板中。分別在每孔中加入終濃度分別為 10μg/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和刀豆蛋白 A(Concanavalin A, ConA), 空白組加入PBS, 每種處理組設(shè)3個(gè)平行, 分別于4、8、12和24h取樣。將樣品于4°C、500g條件下離心10min去除培養(yǎng)基, 加入500μL TRIzol –80°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取和cDNA一鏈合成

參考TRIzol(全式金)說(shuō)明書分別提取紅笛鯛各組織總 RNA, 紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度, 使其OD260/OD280在 1.8—2.0。按照 M-MLV(TaKaRa)說(shuō)明書合成 cDNA一鏈。另取脾臟的總 RNA, 按 RACE試劑盒(Clontech)說(shuō)明書分別合成用于RACE-PCR的cDNA一鏈。

1.5 紅笛鯛CD4和CD4-2 cDNA克隆

1.5.1 基因部分序列克隆 依據(jù) GenBank已提交的魚類CD4基因cDNA序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CD4F與CD4R(表1), 運(yùn)用降落PCR從紅笛鯛頭腎cDNA第一鏈中擴(kuò)增紅笛鯛CD4基因的部分序列,反應(yīng)條件為: 95°C 預(yù)變性 3min, 94°C 30s, 62°C 30 s,72°C 1min 5 個(gè)循環(huán); 94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 1min 5個(gè)循環(huán); 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 1min 25 個(gè)循環(huán),72°C延伸6min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳, 目的條帶切膠后用GeneJET Kit (Thermo Scientific)進(jìn)行回收, 與pMD-19T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài), 陽(yáng)性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers for cloning and expression

1.5.2 3′ RACE和5′ RACE 根據(jù)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得的CD4基因部分序列和紅笛鯛頭腎轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序獲得CD4-2基因部分序列設(shè)計(jì)特異性巢式3′RACE 和 5′RACE 引物(表 1)。 將 3′CD4F1、3′CD4-2F1 和 5′CD4R1、5′CD4-2R1 分別與 UPM Mix引物進(jìn)行3′ RACE與5′ RACE第一輪降落PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為: 95°C 預(yù)變性 3min, 94°C 30s, 68°C 2min 5 個(gè)循環(huán); 94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 2min 5 個(gè)循環(huán);94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 2min 25 個(gè)循環(huán), 72°C 延伸6min。將第一輪 PCR產(chǎn)物稀釋 10倍為模板, 將3′CD4F2、3′CD4-2F2 和 5′CD4R2、5′CD4-2R2 分別與NUP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性 3min, 94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 2min 30 個(gè)循環(huán),72°C延伸6min。PCR產(chǎn)物回收和測(cè)序同1.5.1。

1.6 生物學(xué)信息分析

Blast程序進(jìn)行序列同源性分析; protparam軟件預(yù)測(cè)分子量(Mw)和理論等電點(diǎn)(pI)等; SignalP 4.0 Server軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子信號(hào)肽; TMHMM Server 2.0軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子跨膜區(qū); NetGlyc1.0軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子N-糖基化位點(diǎn); SMART軟件分析蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域; Clustalw 2及MEGA 5.0軟件以鄰位相連法(Neighbor-Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。物種 CD4分子序列號(hào)見(jiàn)表2。

1.7 熒光定量PCR和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將合成的cDNA第一鏈以1︰5—10稀釋后作為qPCR的模板, 根據(jù)紅笛鯛CD4和CD4-2基因ORF設(shè)計(jì) qPCR引物 reCD4F、reCD4R和 reCD4-2F、reCD4-2R(表 1),β-actin作為內(nèi)參基因, 反應(yīng)和分析在Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行。qPCR反應(yīng)條件為: 95°C 20s, 62°C 20s,72°C 20s, 40個(gè)循環(huán)。通過(guò) 2-ΔΔCT法計(jì)算紅笛鯛CD4和CD4-2基因的相對(duì)表達(dá)量, 應(yīng)用 SPSS 11.0 for windows軟件對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Tukey HSD多重比較。*表示與同期對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。

表2 不同物種CD4分子GenBank登錄號(hào)Tab.2 GenBank accession numbers of CD4 in different species

2 結(jié)果

2.1 CD4和CD4-2基因的cDNA克隆與序列分析

紅笛鯛CD4基因cDNA全長(zhǎng)2216bp (GenBank登錄號(hào): KF285565), 包含 180bp 5′ UTR、1431bp ORF和605bp 3′ UTR, 推導(dǎo)編碼476個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為53.02kDa和9.44。紅笛鯛CD4分子含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。紅笛鯛CD4-2基因cDNA全長(zhǎng)為 1520bp (GenBank登錄號(hào): KY020127), 包含62bp 5′ UTR、933bp ORF 和 525bp 3′ UTR, 推導(dǎo)編碼310個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)其蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為33.80kDa和9.69。紅笛鯛CD4-2分子不含有N-糖基化位點(diǎn)。

紅笛鯛CD4和CD4-2均屬于I型跨膜蛋白分子,包含信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)四個(gè)結(jié)構(gòu)域。CD4分子胞外區(qū)為4個(gè)Ig樣區(qū)(D1-C1-D2-C2)。紅笛鯛的胞外區(qū)含有 7個(gè)在魚類或與哺乳動(dòng)物之間保守的 Cys殘基(Cys101, Cys141, Cys185, Cys225, Cys310,Cys349和Cys399)。CD-2分子蛋白胞外區(qū)包含2個(gè)Ig樣區(qū)(D1-D2)和連接肽區(qū)。紅笛鯛的胞外區(qū)含有 6個(gè)在魚類保守的 Cys殘基(Cys34, Cys94, Cys127, Cys168,Cys213和Cys216)。魚類中保守的色氨酸殘基和CXXC基序分別存在于CD4-2分子的Ig樣區(qū)(D1—D2)和連接肽區(qū)。在紅笛鯛CD4和CD4-2胞漿區(qū)均存在高度保守的p56lck的結(jié)合位點(diǎn)CXC基序(圖1, 圖2)。

2.2 CD4和CD4-2氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用BLAST程序?qū)⒓t笛鯛CD4和CD4-2的氨基酸序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄的其他物種的 CD4和 CD4-2分別進(jìn)行同源性比較, 結(jié)果顯示紅笛鯛與其他物種的CD4具有不同程度的同源性, 與斜帶石斑魚的 CD4同源率最高達(dá) 58.5%, 與智人(Homo sapiens)的同源性最低為 21.7%(圖 1)。其中紅笛鯛CD4-2和大黃魚(Larimichthys crocea)的CD4-2同源率最高達(dá) 56.2%, 與其他魚類的 CD4-2同源率達(dá)39.2%—48.6%(圖 2)。利用 MEGA 6.0的 Neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果如圖 3顯示, 鳥類和哺乳動(dòng)物聚成簇, 與魚類形成獨(dú)立的進(jìn)化分支。紅笛鯛 CD4和 CD4-2與硬骨魚鱸形目的斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)及大黃魚聚為一支, 表明它們親緣關(guān)系最近, 與鳥類和哺乳類遺傳距離較遠(yuǎn),七鰓鰻(Petromyzon marinus)CD4與其他魚類的CD4-2聚在一起, 表明該分子可能是已知CD4分子的原基。

2.3 CD4和CD4-2在健康紅笛鯛組織中的分布

應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)CD4和CD4-2在健康紅笛鯛不同組織中的表達(dá)水平, 結(jié)果顯示, CD4和CD4-2在鰓、頭腎、肝、脾、腎、心臟、腸、腦、胃、皮膚和肌肉等組織中均有表達(dá), 在胸腺的表達(dá)量最高, 其次為中腎、鰓、皮膚、脾、頭腎和腸, 其他組織表達(dá)量較低(圖 4)。

圖1 紅笛鯛CD4與其他物種CD4氨基酸序列比較Fig.1 Multiple alignments of snapper CD4 and other species CD4 sequences

圖6 紅笛鯛頭腎淋巴細(xì)胞在兩種免疫刺激劑體外刺激后CD4-2基因的表達(dá)變化Fig.6 Snapper CD4-2 expression analysis of cultured head kidney leukocytes after in vitro stimulation with LPS and ConA

2.4 淋巴細(xì)胞體外刺激后CD4和CD4-2的表達(dá)變化

紅笛鯛頭腎淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)LPS和ConA刺激后, CD4和CD4-2表達(dá)量在試驗(yàn)期間內(nèi)均有明顯的升高(圖5, 圖6)。在刺激后4h, CD4的表達(dá)量開(kāi)始升高，LPS處理組在 12h達(dá)到最高, 與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05), ConA處理組的CD4的表達(dá)量在8h和12h時(shí)較高, 與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05), 然后逐漸下降至正常表達(dá)水平。與CD4的表達(dá)相類似, LPS處理組和ConA處理組的CD4-2在刺激后開(kāi)始輕微上調(diào)表達(dá), 并在12h達(dá)到最高表達(dá)水平, 與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)。

2.5 滅活哈維氏弧菌免疫紅笛鯛后CD4和CD4-2基因的表達(dá)分析

應(yīng)用熒光定量 PCR檢測(cè)了哈維氏弧菌疫苗免疫后4、8、12、24、48和72h后CD4和CD4-2在紅笛鯛鰓、頭腎、脾臟和腸的表達(dá)變化。結(jié)果顯示, 哈維氏弧菌疫苗免疫后的8h,CD4基因在鰓和腸中顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.05), 并在 12h達(dá)到最高, 在頭腎和脾臟中的表達(dá)量均于24h達(dá)到最高(P＜0.05) (圖7, 圖8)。CD4-2基因表達(dá)量在鰓和腸于免疫后的12h達(dá)到峰值(P＜0.05), 在頭腎和脾臟則于24h達(dá)到峰值(P＜0.05)。

3 討論

本研究通過(guò)RACE-PCR技術(shù)獲得了紅笛鯛CD4和 CD4-2的 cDNA全長(zhǎng)序列, 分別編碼 462和 223個(gè)氨基酸, 與已發(fā)現(xiàn)的其他魚類和哺乳動(dòng)物的 CD4結(jié)構(gòu)相類似, 紅笛鯛CD4和CD4-2分子均含有信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū), 具有一些高度保守的氨基酸殘基、N-糖基化位點(diǎn)和功能基序, 對(duì)于T細(xì)胞分化、成熟和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用(Parnes, 1989)。

圖7 哈維氏弧菌感染后鰓、頭腎、脾和腸中CD4的表達(dá)Fig.7 The relative expression level of CD4 in gills, head kidney, spleen and intestine after V. harveyi immunization

圖8 哈維氏弧菌感染后鰓、頭腎、脾和腸中CD4-2的表達(dá)Fig.8 The relative expression level of CD4-2 in gills, head kidney, spleen and intestine after V. harveyi immunization

紅笛鯛 CD4胞外區(qū)主要是由 4個(gè) Ig樣結(jié)構(gòu)域(D1-D4)構(gòu)成。除D1區(qū)外, 其他3個(gè)區(qū)都含有兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基, 用以形成具有穩(wěn)定 Ig折疊作用的結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵。與哺乳動(dòng)物和鳥類不同的是, 魚類的 D1區(qū)只含有一個(gè)半胱氨酸殘基, 該區(qū)域不能形成二硫鍵連接。在 D2和 D4區(qū), 魚類和哺乳動(dòng)物的半胱氨酸殘基相對(duì)比較保守, 但斑馬魚、白鯨和鳥類D2區(qū)卻缺少一個(gè)半胱氨酸殘基, 導(dǎo)致魚類CD4分子在空間構(gòu)象上可能不同于高等脊椎動(dòng)物 CD4分子(Romanoet al, 1999)。由于D1與D2 是CD4分子在抗原識(shí)別過(guò)程中與 MHC II分子主要結(jié)合部位(Claytonet al, 1989; Huanget al, 1997), 因此不同物種CD4分子構(gòu)象不同可能影響Th細(xì)胞的功能(Sunet al, 2007)。此外, 紅笛鯛D3區(qū)也存在硬骨魚類所特有的一對(duì)半胱氨酸殘基, 形成了一個(gè)額外的二硫鍵, 而鳥類和哺乳類在該區(qū)域均缺失了兩個(gè)半胱氨酸殘基,因此對(duì)該二硫鍵的功能有待進(jìn)一步研究。

人CD4分子D1區(qū)的FXXK基序是MHC II分子的結(jié)合位點(diǎn), 其中結(jié)合能主要由F提供, 但鳥類、小鼠和一些魚類缺乏該此位點(diǎn), 相反紅笛鯛、大黃魚和大西洋庸鰈的CD4-2分子的D1區(qū)均含有該基序, 因此魚類CD4與MHC II分子可能存在一種不同于人的的結(jié)合方式。此外所有物種的CD4和CD4-2分子D2區(qū)均存在一個(gè)特有的WXC基序, 并且該基序在脊椎動(dòng)物的淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activation gene 3, LAG-3)的D4區(qū)也同樣保守, 據(jù)此推測(cè)CD4和 LAG-3可能來(lái)源于同一個(gè)祖先, 并通過(guò)含有兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的 CD4-2分子通過(guò)基因內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生(Triebelet al, 1990; Lainget al, 2006)。紅笛鯛CD4-2連接肽區(qū)含有一個(gè) CXXC基序, 該基序在目前已知硬骨魚類如大黃魚、大西洋庸鰈、紅鰭東方 鲀和虹鱒中高度保守, 用以形成連接二聚體的二硫鍵, 目前已證明CD4二聚化在CD4介導(dǎo)的T細(xì)胞激活中必不可少, 而且可以促進(jìn)與 MHC II鏈接(Moldovanet al,2006)。同時(shí)魚類 CD4-2連接肽區(qū)富含脯氨酸, 使肽鏈伸更易于伸展彎曲接觸 MHC II(Buonocoreet al,2008)。與所有的鳥類、哺乳動(dòng)物和魚類CD4相類似,紅笛鯛CD4和CD4-2胞內(nèi)區(qū)均含有一個(gè)高度保守的p56lck結(jié)合基序 CXC, 該基序通過(guò)鋅指拉鏈結(jié)構(gòu)與p56lck的CXXC基序連接相連接啟動(dòng)T細(xì)胞激活的第一信號(hào)(Kimet al, 2003), 進(jìn)而導(dǎo)致CD3分子胞內(nèi)域的ITAM部分的磷酸化和fyn以及活化ZAP-70等下游信號(hào)分子, 最終T細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活得以完成(Leoet al, 2001)。高等脊椎動(dòng)物的CD4分子胞內(nèi)區(qū)的CXC基序上游含有兩個(gè)保守的絲氨酸殘基和LL基序,這 4個(gè)保守氨基酸參與抗原誘導(dǎo) CD4分子的內(nèi)化(Shinet al, 1990), 但是在魚類CD4和CD4-2分子中均不存在, 因此有關(guān)魚類控制T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化以保持免疫系統(tǒng)平衡的機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

蛋白糖基化影響蛋白質(zhì)的折疊、成熟、包裝、投送、定位和抗原性以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接(章曉聯(lián), 2004)。糖基化對(duì)T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能同樣也起到非常重要的作用, CD4分子的糖基化位點(diǎn)糖基化完全后才能正確折疊和表達(dá)于細(xì)胞膜上(Ruddet al,2001)。魚類 CD4分子含多個(gè) N-糖基化位點(diǎn), 位于D3和 D4結(jié)構(gòu)域的糖基化位點(diǎn)的在所有物種中均相對(duì)保守, 預(yù)示魚類CD4分子與高等脊椎動(dòng)物CD4分子具有相似的部分功能。

熒光定量 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示紅笛鯛 CD4和CD4-2在胸腺中表達(dá)量最高, 在中腎、鰓、皮膚、腸和頭腎等組織中也有中等程度的表達(dá), 這種組織表達(dá)模式與舌齒鱸、大西洋庸鰈和虹鱒相似(Lainget al,2006; Buonocoreet al, 2008; Patelet al, 2009;) , 但是與紅鰭東方 鲀和斑點(diǎn)叉尾不同(Suetakeet al, 2004 ;Edholmet al, 2007), 可能與種屬、生活環(huán)境及生理狀態(tài)有關(guān)。胸腺是硬骨魚的中樞免疫器官(謝海俠等,2003)。CD4的高表達(dá)證實(shí)其是魚類T細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化和成熟的主要場(chǎng)所。魚類皮膚、鰓和腸是魚類主要的黏膜淋巴組織, 也是最早接觸水體病原的部位, 目前研究發(fā)現(xiàn)其中含有大量T淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(Antigen-Presenting Cells, APC)和B淋巴細(xì)胞組織(Fournier-Betzet al, 2000; Romboutet al,2014), 具有引發(fā)免疫應(yīng)答的細(xì)胞基礎(chǔ), CD4分子這些組織中的表達(dá)表明紅笛鯛黏膜組織中同樣含有CD4+T細(xì)胞, 病原入侵時(shí)其可引起局部黏膜免疫應(yīng)答, 在抵御病原入侵和免疫反應(yīng)中起重要作用。頭腎淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)LPS和ConA刺激后,CD4 mRNA顯著上調(diào)表達(dá), 與小鼠和舌齒鱸上的研究結(jié)果相一致(McAleeret al, 2007), 表明魚類的CD4+T細(xì)胞與哺乳類CD4+T具有相似的特性(Todaet al, 2011), 膜上含有絲分裂原受體, 與LPS和ConA結(jié)合后可刺激其增殖。

CD4+T細(xì)胞在外周器官識(shí)別抗原肽與MHC II類分子形成的復(fù)合物后被激活, 成為輔助 T細(xì)胞(Th),參與細(xì)胞免疫和體液免疫, 在抗菌感染中發(fā)揮重要作用。耶爾森氏菌(Yersinia ruckeri)滅活疫苗浸泡免疫8h后虹鱒CD4顯著上調(diào)表達(dá)(Raidaet al, 2008), Kato等(2013)等用胞內(nèi)病原海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)和病毒性出血性敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)感染牙鲆, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)上述病原感染后5d中腎CD4mRNA呈現(xiàn)中等程度的持續(xù)上調(diào)表達(dá),而CD4-2mRNA表達(dá)水平顯著上升, 其相對(duì)表達(dá)量高于 CD4, 表明主要觸發(fā) Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,CD4-2+T細(xì)胞在感染早期大量增殖, 并認(rèn)為 CD4和CD4-2存在于不同亞型的 T細(xì)胞, 分別表達(dá)于初始Th細(xì)胞和記憶Th細(xì)胞。本研究中紅笛鯛經(jīng)哈維氏弧菌疫苗免疫24h后鰓、頭腎、脾臟和腸CD4和CD4-2表達(dá)量均顯著上調(diào), 表明哈維氏弧菌疫苗免疫后引起 Th大量增殖, 與耶爾森氏菌滅活疫苗浸泡免疫虹鱒的結(jié)果相似, 與Kato等(2013)的研究結(jié)果不太相同,可能與病原的種類、感染方式及宿主等有關(guān), 有關(guān)CD4-1和CD4-2分子分別表達(dá)或共表達(dá)以及免疫反應(yīng)過(guò)程中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。綜上所述, CD4和CD4-2在魚類的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得了紅笛鯛CD4和CD4-2基因,均由信號(hào)肽、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成, 健康紅笛鯛CD4和CD4-2基因在健康魚的胸腺中表達(dá)量最高, 其次是中腎、鰓、皮膚、脾、頭腎和腸。紅笛鯛頭腎淋巴細(xì)胞體外經(jīng)LPS和ConA刺激12h后, CD4和CD4-2表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)。哈維氏弧菌疫苗免疫24h后鰓、頭腎、脾臟和腸的表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。研究結(jié)果為進(jìn)一步制備單克隆抗體、分選不同的T細(xì)胞亞群以及不同亞群的功能鑒定提供了基礎(chǔ)。

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