史雨紅 馬海玲 梁亞芳 陳 航 陳 炯

(寧波大學海洋學院 生物化學與分子生物學實驗室 寧波 315211)

LECT2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2)為白細胞源趨化因子, 分子量為 16kDa, 含三個分子內(nèi)二硫鍵, 以持續(xù)性方式在肝中特異表達, 隨后分泌到血液中(Yamagoeet al, 1996)。哺乳動物研究表明,LECT2是一種多功能的細胞因子, 它與腫瘤發(fā)生、肝損傷、膿毒血癥、腎淀粉樣病變及造血干細胞動員等生理病理過程緊密相關(guān)(Saitoet al, 2004; Luet al,2013a; Lanet al, 2014; Luet al, 2016)。據(jù)報道, LECT2在魚類中廣泛存在, 多種水產(chǎn)經(jīng)濟魚類如鯉魚(Fujikiet al, 2000)、虹鱒(Kokkinoset al, 2005)、大黃魚(Liet al, 2008)和香魚(Chenet al, 2010)等中均有鑒定報道。魚類 LECT2基因表達與病原菌感染緊密相關(guān)(Linet al, 2007; Liet al, 2008; 施曉峰等, 2010; Chenet al,2010; Weiet al, 2011), 揭示 LECT2 可能在魚類抗菌免疫反應中具有重要的作用。我們的研究表明, 重組香魚 LECT2成熟肽(rPaLECT2m)能體外趨化香魚頭腎來源的單核巨噬細胞(monocytes/macrophages,MO/MΦ), 誘導白介素 1β (interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor α, TNFα)、白介素 10 (interleukin-10, IL-10)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)等細胞因子及模式識別受體(pattern recognization receptor,PRR)等基因表達, 增強 MO/MΦ 吞噬和殺菌能力(Zhanget al, 2011; Luet al, 2013b)。隨后, 我們對鰻弧菌感染的香魚進行腹腔注射 rPaLECT2m處理, 發(fā)現(xiàn)感病香魚的存活率提高、組織載菌量減少、組織病理損傷減輕, 去除MO/MΦ后, 這種促病情改善的作用被抑制, 揭示魚類中 LECT2增強機體免疫能力的作用是通過MO/MΦ介導的(Chenet al, 2014b)。

MO/MΦ能表達多種 PRRs, 如 Toll樣受體(toll like receptor, TLR)及多類 C型凝集素受體(C-type lectin receptor, CLR), 這些 PRRs介導MO/MΦ識別微生物表面保守但不存在于宿主中的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP),通過下游的信號途徑, 調(diào)節(jié)各種免疫反應基因的表達從而清除病原體(Kerriganet al, 2009)。CLR家族成員擁有一個或多個糖基識別結(jié)構(gòu)域(carbohydraterecognition domains, CRDs), 介導對病原的黏附、攝取和殺滅, 調(diào)控免疫反應(Kerriganet al, 2009)。近年來, 魚類 CLRs基因的研究日益受到重視, 一些同源基因已被克隆和研究(Soaneset al, 2004; Linet al,2009; Aoet al, 2015; Yanget al, 2015; Zhanget al,2015; Chenet al, 2016)。我們采用酵母雙雜交和免疫共沉淀方法, 鑒定 PaLECT2能與一種香魚 CLR(PaCLR)相互作用(Chenet al, 2010); 進一步研究揭示, PaLECT2可通過PaCLR受體介導激活靜息狀態(tài)下的香魚MO/MΦ (Maet al, 2016)。然而, 病理狀態(tài)下PaLECT2/PaCLR途徑是否發(fā)揮作用尚不得而知。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要組成部分, 可作為單核巨噬細胞的一種有效的激活劑(Swainet al, 2008), 本研究擬采用LPS刺激靜息態(tài)香魚 MO/MΦ模擬病理狀態(tài), 闡明PaCLR是否介導 PaLECT2激活病理狀態(tài)下的 MO/MΦ, 揭示 LECT2在魚類炎癥反應中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

健康香魚(Plecoglossus altivelis) (40—50g)購自浙江省寧波市寧?？h鳧溪香魚養(yǎng)殖基地, 大小均勻,體表無傷。實驗進行之前在實驗室條件下(水溫 20±1oC, 保證溶氧量適宜及水質(zhì)清潔無菌)暫養(yǎng)2周。引物由上海英俊生物有限公司合成; 總 RNA抽提試劑RNAiso和 SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自TaKaRa公司; 二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG)購自碧云天生物技術(shù)研究所; Ficoll購自GE公司;LPS (Escherichia coli055: B5)和熒光素FITC購自美國Sigma。細胞培養(yǎng)基RPMI 1640購自上海英俊生物有限公司。胎牛血清(FBS)、硫酸鏈霉素和青霉素均購自美國Gibco公司。

1.2 rPaLECT2m蛋白和PaCLR抗體制備

rPaLECT2m的制備及純化方法參照文獻(Zhanget al, 2011)。PaCLR抗體(anti-PaCLR)制備方法參照文獻(Maet al, 2016)。

1.3 香魚頭腎MO/MΦ的分離與培養(yǎng)

香魚頭腎 MO/MΦ的分離和培養(yǎng)參照文獻(Chenet al, 2014b)。簡述如下: 香魚麻醉后尾靜脈取血后取頭腎。用細胞洗脫培養(yǎng)基I將香魚頭腎用100μm孔徑篩網(wǎng)研磨過濾。濾液(1:2)鋪在 Ficoll表面,2000r/min水平離心 25min。吸取中間白膜層, 用細胞洗脫培養(yǎng)基I重懸, 2000r/min水平離心8min。沉淀用上述的培養(yǎng)基II洗一次, 1000r/min離心5min。顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù), 最后細胞稀釋至 2×107/mL,平鋪于 35mm細胞培養(yǎng)皿。24oC過夜培養(yǎng)后將培養(yǎng)液換成完全培養(yǎng)基, 用于后續(xù)實驗。

1.4 實時定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)檢測香魚MO/MФ細胞因子表達

采用qPCR檢測香魚MO/MФ中TNFα、IL-1β、IL-10和粒細胞集落刺激因子G-CSF的表達變化, 以18S rRNA為內(nèi)參(Maet al, 2016)。以10μg/mL的LPS處理香魚MO/MФ 30min之后用PBS洗滌去除, 然后用200μg/mL anti-PaCLR封閉40min, isoIgG作為對照;隨后加入rPaLECT2m (2.5μg/mL)孵育3.5h, PBS組為對照, 收集細胞并提取總 RNA 合成 cDNA。TNFα,IL-1β, IL-10和G-CSF的擴增引物見文獻(Chenet al,2014b; Maet al, 2016)。qPCR 程序為: 94oC 180s(預變性); 94oC 30s, 60oC 30s, 72oC 30s(擴增段, 40 個循環(huán)); 94oC 30s, 72oC 60s, 95oC 30s(熔解段)。每個樣品重復四次, 使用2–ΔΔCT方法計算在不同樣品基因的相對表達水平。

1.5 流式細胞術(shù)檢測香魚MO/MΦ吞噬作用

香魚 MO/MΦ吞噬實驗參考文獻(Maet al,2016)。簡述如下: 香魚 MO/MΦ LPS處理、anti-PaCLR封閉和 PaLECT2m孵育如 1.4。收集對數(shù)生長期大腸桿菌DH5α并用異硫氰酸熒光素(FITC)對其進行標記(記作E. coli-FITC)。之后(MOI=10)加入E. coli-FITC處理30min。PBS洗滌3次, 用0.4%臺盼藍使粘附到細胞表面的熒光猝滅。流式細胞儀(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)對吞噬作用進行檢測, 圖像分析采用FlowJo軟件。相對平均熒光強度(MFI)=處理組MFI /無細菌組MFI, 以PBS組相對MFI為100%。

1.6 平板計數(shù)法評估香魚MO/MΦ殺菌能力

采用平板計數(shù)法評估香魚 MO/MΦ對細菌的吞噬活性。LPS處理香魚MO/MΦ、anti-PaCLR封閉和PaLECT2m孵育如1.3。將大腸桿菌(MOI=10)添加至香魚MO/MΦ, 24oC培養(yǎng)30min。非內(nèi)化的大腸桿菌用無菌PBS洗滌除去。吞噬組用1% Triton X-100溶液裂解后涂布于 LB瓊脂培養(yǎng)基。殺菌組繼續(xù)培養(yǎng)1.5h, 然后再裂解涂布于 LB瓊脂培養(yǎng)基, 平皿置于37oC培養(yǎng)18h后, 進行菌落計數(shù)。細菌存活率=殺菌組/吞噬組×100%表示, 實驗重復3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±SD表示, 數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 13.0軟件 one-way ANOVA方法進行分析,P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 抗體封閉PaCLR對rPaLECT2m激活LPS刺激的香魚MO/MΦ細胞因子表達的影響

與PBS處理組相比, 香魚MO/MΦ經(jīng)LPS刺激后, IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA表達上調(diào)倍數(shù)分別為 12、15、1.9和 5.8, 而 LPS+rPaLECT2m 處理后 IL-1β、TNFα、IL-10和 G-CSF基因 mRNA表達水平分別上調(diào)約為 PBS處理組的350、160、12和 38; 用 anti-PaCLR封閉細胞上的PaCLR后, LPS+rPaLECT2m再處理香魚MO/MΦ, 其IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA表達上調(diào)約為PBS處理組的75、31、3.1和9.2(圖1)。

2.2 抗體封閉PaCLR對rPaLECT2m激活LPS刺激的香魚MO/MΦ吞噬能力的影響

與PBS處理組相比, LPS處理和LPS+anti-PaCLR處理對香魚 MO/MΦ吞噬能力均無顯著影響(圖2A)。與PBS處理組相比, LPS+rPaLECT2m處理顯著增強香魚 MO/MΦ吞噬E.coli-FITC的能力, 其相對MFI約為PBS處理組增加了88.9%(圖2B); 用抗體封閉PaCLR后, LPS+rPaLECT2m再處理香魚MO/MΦ,吞噬E.coli-FITC的能力相對于PaCLR未封閉組下降了約 35.6%(圖 2C, 圖 2D)。

2.3 抗體封閉PaCLR對rPaLECT2m激活LPS刺激的香魚MO/MΦ殺菌能力的影響

實驗分為5組, 其中PBS處理組、LPS處理組,LPS+anti-PaCLR處理組, LPS+rPaLECT2處理組和LPS+anti-PaCLR+rPaLECT2m處理組細菌存活率分別為 34.0%±2.9%, 32.9%±1.5%, 36.5%±3.6%,16.5%±2.6%和27.9%±2.9%(圖3)。與LPS處理組相比, 抗體封閉PaCLR對LPS刺激的香魚MO/MΦ殺菌能力無顯著性影響; 與 LPS處理組相比, LPS+rPaLECT2m處理顯著增強了香魚MO/MΦ的殺菌能力,然而抗體封閉PaCLR后, rPaLECT2m對LPS刺激的香魚MO/MΦ殺菌能力的增強效應被顯著抑制。

圖1 抗體封閉PaCLR對rPaLECT2m激活LPS刺激的香魚MO/MΦ中IL-1β (A), TNFα (B), IL-10 (C) and G-CSF (D)基因mRNA表達的影響Fig.1 Effect of PaCLR blockage on rPaLECT2m activation of mRNA expression of IL-1β (A), TNFα (B), IL-10 (C) and G-CSF (D)from LPS-stimulated ayu MO/MΦ

圖2 封閉PaCLR對rPaLECT2m激活LPS的香魚MO/MΦ吞噬功能的影響Fig.2 Effect of PaCLR blockage on rPaLECT2m activation of phagocytosis of LPS-stimulated ayu MO/MΦ

圖3 抗體封閉PaCLR對rPaLECT2m激活LPS刺激的香魚MO/MΦ殺菌能力的影響Fig.3 Effect of PaCLR blockage on rPaLECT2m activation of bacterial killing of LPS-stimulated ayu MO/MΦ

3 討論

LECT2是一個新近鑒定的多功能細胞因子, 它可作用于魚類 MO/MΦ, 趨化靜息態(tài)的 MO/MΦ, 增強其細胞因子表達、吞噬和殺菌能力(Zhanget al,2011; Luet al, 2013b; Maet al, 2016)。PaCLR是PaLECT2在香魚 MO/MΦ上的受體, 并介導PaLECT2激活靜息態(tài)MO/MΦ (Chenet al, 2010; Maet al, 2016)。然而, 由于病理條件下MO/MΦ的狀態(tài)往往與靜息態(tài)時不同, 因此有必要針對病理狀態(tài)開展研究。LPS是革蘭陰性菌的胞壁主要組成成分, 在革蘭氏陰性菌感染的發(fā)病機理中起著十分重要的作用(Swainet al, 2008), 前人研究表明, LPS刺激能導致免疫細胞發(fā)生形態(tài)、功能和胞內(nèi)基因表達等的變化,合成并釋放一系列炎癥介質(zhì), 參與機體的炎癥級聯(lián)反應, 從而引起感染性休克、器官損傷和系統(tǒng)性炎癥反應綜合癥等(Morriset al, 2015)。本文采用LPS刺激來模擬病理狀況, 研究PaCLR是否介導rPaLECT2激活LPS刺激的香魚MO/MΦ。

小鼠中的研究表明, LECT2處理靜息態(tài)小鼠MΦ后, C3、G-CSF、IFNγ、IL-10、CXCL-10、IL-1β 和TNFα等基因mRNA表達均上調(diào); 與之相比, LECT2處理LPS刺激的小鼠MΦ后, 上述基因mRNA表達水平進一步增加2—40倍不等(Luet al, 2013a), 揭示小鼠LECT2在病理條件下能激活MΦ中多種重要免疫相關(guān)基因的表達。魚類中研究發(fā)現(xiàn), rPaLECT2m處理上調(diào)靜息態(tài)香魚MO/MΦ細胞因子IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA的表達, 增強MO/MΦ吞噬和殺菌能力(Zhanget al, 2011; Luet al, 2013b; Maet al, 2016)。本研究中, 我們發(fā)現(xiàn) rPaLECT2m處理LPS刺激的香魚MO/MΦ后, IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF等基因mRNA表達分別為rPaLECT2m處理的靜息態(tài)MO/MΦ中的1.60、1.77、1.58和1.38倍, 和小鼠中報道的變化趨勢一致, 揭示, rPaLECT2處理可能也不抑制香魚極早期的炎性反應。

新近研究表明, 哺乳動物中 LECT2的受體有兩個, 分別為 CD209a和 c-Met, 其中 CD209a介導LECT2激活在小鼠 MΦ, 增強保護性免疫(Luet al,2013a; Chenet al, 2014a)。魚類中, PaCLR被鑒定為PaLECT2在香魚MO/MΦ上的一個受體, 它的結(jié)構(gòu)和小鼠CD209a有一定相似性(Chenet al, 2010), 它能介導 LECT2激活靜息態(tài)香魚 MO/MΦ功能(Maet al,2016)。本研究表明, 抗體封閉PaCLR后, rPaLECT2m對LPS處理的香魚MO/MΦ細胞因子表達、吞噬和殺菌能力增強效應顯著受到抑制, 揭示 PaCLR介導PaLECT2對病理條件下的香魚MO/MΦ功能。

4 結(jié)論

綜上所述, rPaLECT2m激活 LPS刺激香魚MO/MΦ細胞因子表達、吞噬和殺菌功能?？贵w封閉PaCLR后顯著抑制上述作用, 因此, 無論在靜息狀態(tài)還是LPS刺激作用下PaCLR都介導了PaLECT2激活香魚MO/MΦ功能。

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