朱 瑩，王 婧，沈立軍，王志遙，顏天銘，王玉玉，邱玉華

B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)

朱 瑩1，王 婧2a，沈立軍2b，王志遙2c，顏天銘2c，王玉玉2c，邱玉華2c

目的探討在誘導(dǎo)cGVHD小鼠狼瘡樣腎炎模型并通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)鑒定其造模成功的基礎(chǔ)上，運(yùn)用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗體阻斷B7/CD28共刺激信號(hào)通路對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型病理?yè)p傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。方法將6～8周齡雌性(C57BL/6×BALB/c)BCF1小鼠隨機(jī)分為4組，模型組于0、3、7和11 d經(jīng)眼眶靜脈注射100 μL雌性親代BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞107/只?？贵w干預(yù)組在造模后第1、3、5、8、15、30及60天分別經(jīng)眼眶靜脈注射100 μL B7-1人-鼠嵌合抗體(克隆號(hào)2B11) 200 μg/只，環(huán)磷酰胺(CTX)干預(yù)組在末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8、15天分別腹腔注射100 μL CTX 2.5 mg/只。按照上述時(shí)間點(diǎn)分析小鼠抗dsDNA抗體、ANA及尿蛋白含量，12周時(shí)處死小鼠觀察腎臟組織HE染色、免疫復(fù)合物(IC)沉積等情況。結(jié)果模型組100%小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量為++～++++，抗體干預(yù)組12周時(shí)僅有30%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量為+～++；12周時(shí)與模型組相比，抗體干預(yù)組小鼠血清抗dsDNA抗體陽(yáng)性率由50%降至0；抗體干預(yù)組ANA陽(yáng)性率由90%降至40%，且熒光面積與熒光亮度均下降；HE染色鏡下觀察，抗體干預(yù)組腎小球囊腔大小較為均一，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；直接免疫熒光法可見抗體干預(yù)組腎小球血管襻IC沉積減少。結(jié)論B7-1人-鼠嵌合抗體可通過(guò)阻斷或削弱B7/CD28共刺激信號(hào)通路，減少自身抗體和IC生成，逆轉(zhuǎn)狼瘡腎炎的病理?yè)p傷，提示該自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)狼瘡腎炎具有潛在的防治作用。

B7-1人-鼠嵌合抗體；抗核抗體；免疫干預(yù)；cGVHD；狼瘡腎炎

0 引言

B7-1(又稱CD80)是表達(dá)于活化B淋巴細(xì)胞、活化T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面的重要共刺激分子，是T淋巴細(xì)胞活化時(shí)必需的膜抗原。B7-1與相應(yīng)的受體CD28結(jié)合，其介導(dǎo)的共刺激信號(hào)不僅能促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖、分化，也是T細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)所必需的[1]。該信號(hào)通路過(guò)度活化，則有可能導(dǎo)致自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)的發(fā)生[2]。

AID的發(fā)病原理是自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞過(guò)度活化，產(chǎn)生大量自身抗體。這些自身抗體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的累及多系統(tǒng)、多器官的一類全身性疾病。SLE是AID的典型代表。B7/CD28共刺激信號(hào)通路的過(guò)度活化與AID的發(fā)生密切相關(guān)，已有文獻(xiàn)報(bào)道B7-1和B7-2單克隆抗體可有效減少SLE模型小鼠免疫細(xì)胞的活化，自身抗體的生成，逆轉(zhuǎn)SLE的腎臟病理?yè)p傷。

嵌合抗體(Chimeric antibody)是由鼠源性抗體的可變區(qū)基因與人抗體的恒定區(qū)基因拼接而成的嵌合基因，插入載體后轉(zhuǎn)染至骨髓瘤組織表達(dá)的抗體分子。因其減少了鼠源成分，從而降低了人抗鼠抗體反應(yīng)(Human anti-murine-antibody response,HAMA)[3]的發(fā)生，成為了新的研究熱點(diǎn)。

本研究在建立和人SLE類似的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)小鼠狼瘡樣腎炎疾病模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上[4]，運(yùn)用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗體阻斷B7/CD28共刺激信號(hào)通路對(duì)其進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)分析尿蛋白動(dòng)態(tài)變化、血清中ANA和dsDNA含量、腎臟病理學(xué)改變等指標(biāo)動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)嵌合抗體對(duì)疾病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)[5]，同時(shí)為該類疾病尋找新的特異、高效、低毒的生物干預(yù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡C57BL/6雄性小鼠5只，體重25～30 g；6～8周齡BALB/c雌性小鼠10只，體重25～30 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；Albustix尿蛋白試紙購(gòu)自美國(guó)Bayer公司；PE-Anti-Human IgG(Fc)抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；PE、堿性磷酸酶(AP)-Goat-Anti-Mice IgG抗體購(gòu)自美國(guó)聯(lián)科生物公司；抗核抗體(ANA)和抗dsDNA抗體檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京和杰創(chuàng)新生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；分泌B7-1人-鼠嵌合抗體的基因工程細(xì)胞株CHO-ch4E5(克隆號(hào)2B11)由本室自行研制。

1.2 方法

1.2.1 B7-1人-鼠嵌合抗體的制備及純化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、能穩(wěn)定分泌B7-1人-鼠嵌合抗體的基因工程細(xì)胞株CHO-ch4E5(克隆號(hào)2B11)重懸接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，37 ℃、5% CO2滾瓶培養(yǎng)。6～7 d后收集上清，高速離心和超濾濃縮后，ProteinG親和層析柱分離純化，機(jī)器自動(dòng)定量，過(guò)濾除菌，-80 ℃保存[6]。

1.2.2 B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)細(xì)胞膜型B7-1分子的識(shí)別 將細(xì)胞株L929-mock、轉(zhuǎn)染人B7-1基因的小鼠成纖維細(xì)胞株L929-B7-1、人淋巴瘤細(xì)胞Daudi和新鮮小鼠脾臟細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞為每管3×105/100 μL，分別加入B7-1人鼠嵌合抗體0.5 μg/10 μL，4 ℃孵育40 min。PBS洗滌后加入2 μL(0.5 mg/mL)PE標(biāo)記Anti-Human IgG(Fc)抗體，4 ℃孵育40 min，充分洗滌后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3 cGVHD小鼠狼瘡樣腎炎模型建立 將6～8周齡雌性(C57BL/6×BALB/c)BCF1小鼠20只隨機(jī)分為4組，每組5只。其中15只于0、3、7和11 d經(jīng)眼眶靜脈注射100 μL雌性親代BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞107/只。其余5只作為對(duì)照組，注射等體積生理鹽水。

1.2.4 B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠疾病模型的免疫干預(yù) 取已經(jīng)造模的15只小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。抗體干預(yù)組：于末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8、15、30、60天分別經(jīng)眼眶靜脈注射100 μL B7-1人-鼠嵌合抗體(克隆號(hào)2B11)200 μg/只[6]；模型組:給予等劑量的人同型IgG；CTX干預(yù)組:于末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8、15天分別腹腔注射100 μL CTX 2.5 mg/只。

1.2.5 尿蛋白含量的測(cè)定 末次注射淋巴細(xì)胞后每2周定時(shí)采集小鼠晨尿，Albustix試紙法檢測(cè)尿蛋白。將試紙反應(yīng)塊浸沒(méi)至尿液中，1 min內(nèi)讀取結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)顯色帶比對(duì)，依據(jù)反應(yīng)區(qū)顯色深淺判斷尿蛋白含量。

1.2.6 血清抗dsDNA抗體和ANA檢測(cè)水平的測(cè)定 末次注射淋巴細(xì)胞后定時(shí)每2周采集小鼠血清，間接免疫熒光法檢測(cè)抗dsDNA抗體：血清1∶100稀釋后，25 μL/孔與抗原片室溫避光孵育30 min，設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照。洗滌后加入抗dsDNA抗體熒光二抗25 μL/孔，室溫孵育30 min，洗滌封片后熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：抗dsDNA抗體陽(yáng)性時(shí)胞核與動(dòng)基體表現(xiàn)為均質(zhì)或環(huán)狀熒光，且熒光為一大一小成對(duì)出現(xiàn)；陰性時(shí)四膜蟲蟲體輪廓清晰，可看到有鞭毛，蟲體內(nèi)無(wú)熒光。

間接免疫熒光法檢測(cè)ANA：血清1∶100稀釋后，25 μL/孔與抗原片室溫避光孵育30 min，設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照。洗滌后加ANA熒光二抗25 μL/孔，室溫孵育30 min，洗滌封片后熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：ANA陰性時(shí)整個(gè)細(xì)胞區(qū)域呈現(xiàn)極微弱亮度和本底相近的均勻熒光，ANA陽(yáng)性時(shí)表現(xiàn)不同的核型，可分為：均質(zhì)型、斑點(diǎn)型(又稱核顆粒型、核斑塊型)、核仁型、核膜型、著絲點(diǎn)型、線粒體型和核糖體型等。

1.2.7 腎臟病理學(xué)改變的觀察 末次造模后12周頸椎脫臼處死所有小鼠。分離腎臟，一側(cè)經(jīng)10%中性福爾馬林固定后制備石蠟切片，HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟腎小球形態(tài)。

1.2.8 小鼠腎臟免疫復(fù)合物(IC)的檢測(cè) 取上述制備好的腎臟石蠟切片，PBS漂洗3次后加3% BSA封閉，加入PE-羊抗鼠 IgG，4 ℃孵育過(guò)夜(18～24 h)，漂洗封片后，置于落射熒光顯微鏡下觀察IC的沉積。

楊年豐疑惑地打量高河一番，走進(jìn)房間坐在床邊，然后雙眼直勾勾地望著高河。高河擦了擦鬢角上流下來(lái)的汗，問(wèn)道：“大表哥，什么事？”

2 結(jié)果

2.1 B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)細(xì)胞膜型B7-1分子的識(shí)別 間接免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，B7-1人-鼠嵌合抗體與L929-mock、L929-B7-1、Daudi和小鼠脾臟細(xì)胞的結(jié)合率分別為1.02%、94.2%、93.8%和54.3%。見圖1。

2.2 小鼠蛋白尿檢測(cè) 模型組小鼠從第2周起有50%的小鼠開始出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量為+～+++。且尿蛋白小鼠數(shù)量和尿蛋白量隨時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸增大。12周時(shí)，模型組100%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量為++～++++；抗體干預(yù)組同期有30%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，且尿蛋白含量均≤++；CTX干預(yù)組同期有40%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量均≤+++。對(duì)照組蛋白尿含量始終為陰性(<+)。見表1。

表1 12周時(shí)各組小鼠尿蛋白程度(只)

注：*與模型組比較，P<0.05

2.3 小鼠血清抗dsDNA抗體和ANA的檢測(cè) 模型組小鼠血清抗dsDNA抗體的檢測(cè)結(jié)果顯示，末次注射14 d時(shí)陽(yáng)性率為20%，28 d時(shí)達(dá)到50%；而ANA在14 d時(shí)陽(yáng)性率為70%，28 d時(shí)上升至90%，以均質(zhì)型和核膜型為主。12周時(shí)，抗體干預(yù)組和CTX干預(yù)組均未檢測(cè)到抗dsDNA抗體，ANA的表達(dá)熒光亮度明顯低于模型組，但仍然高于對(duì)照組。對(duì)照組在任何實(shí)驗(yàn)階段均未檢測(cè)到抗dsDNA抗體和ANA的表達(dá)。見圖2、圖3。

2.4 腎臟組織的病理學(xué)改變 HE染色顯示，模型組小鼠部分腎小球體積代償性增大，腎小球大小不一，腎小球和血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，壁層和臟層上皮細(xì)胞增生，可見細(xì)胞新月體生成。極少部分腎小球體積縮小，周圍纖維化，甚至形成纖維新月體。腎小球囊腔可見厚薄不均一，狹窄，甚至閉塞?？贵w干預(yù)組和CTX干預(yù)組腎臟病理改變輕于模型組，但仍然比對(duì)照組嚴(yán)重。表現(xiàn)為腎小球體積輕度增大，腎小球囊腔厚薄略微不均一，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見新月體。對(duì)照組未見腎小球明顯增大，大小均一，腎小球囊腔清晰可見，淋巴細(xì)胞數(shù)量未見明顯增多。見圖4。

2.5 腎臟組織免疫復(fù)合物熒光染色觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠的腎臟組織切片經(jīng)直接免疫熒光法染色，結(jié)果顯示，模型組腎小球部位有紅色明亮的顆粒狀熒光伴腎小球毛細(xì)血襻分布，可大致反映出腎小球輪廓?？贵w干預(yù)組和CTX干預(yù)組腎小球部位也可見少量微弱熒光，熒光面積和熒光亮度都弱于模型組。對(duì)照組腎小球部位無(wú)熒光。見圖5。

圖1 B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)膜型B7-1分子的識(shí)別

3 討論

紅斑狼瘡是一種嚴(yán)重的全身性自身免疫病，多發(fā)于育齡女性[7]，狼瘡腎炎是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是最常見的死亡原因[8]。目前，臨床上多采用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑來(lái)治療紅斑狼瘡，而這些藥物長(zhǎng)期大量使用會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此，研究通過(guò)干預(yù)共刺激分子的生物療法具有重要的意義和良好的應(yīng)用前景[9]。

B7分子的表達(dá)異常與紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。紅斑狼瘡患者體內(nèi)APC細(xì)胞表面的CD80和CD86分子表達(dá)均高于正常人，提示紅斑狼瘡存在APC異?；罨驮鲋车默F(xiàn)象[10-11]。

目前常用的誘導(dǎo)狼瘡樣腎炎模型的方法有2種：一種是化學(xué)法，利用降植烷(Pristane)的化學(xué)特性構(gòu)建狼瘡樣腎炎模型；另一種是運(yùn)用親代淋巴細(xì)胞注射誘導(dǎo)cGVHD模型[12]。cGVHD模型具有發(fā)病機(jī)理和人類SLE類似，成模迅速(<28 d)，動(dòng)物來(lái)源方便，成本低，發(fā)病率高且穩(wěn)定性好，病理學(xué)特點(diǎn)與人類SLE特點(diǎn)相似等優(yōu)點(diǎn)。尿蛋白的出現(xiàn)是反映腎臟功能受損、腎單位濾過(guò)膜是否完整的重要標(biāo)志[13]。模型組小鼠從第2周起有50%的小鼠開始出現(xiàn)蛋白尿，且隨著時(shí)間的推移，尿蛋白小鼠的數(shù)量和尿蛋白的量也逐漸增大。到12周時(shí)，100%的模型組小鼠出現(xiàn)蛋白尿?？贵w干預(yù)組12周時(shí)有30%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白的嚴(yán)重程度也較模型組有所減輕。

圖2 小鼠12周血清抗dsDNA抗體的表達(dá)(100×)

圖3 小鼠12周血清ANA的表達(dá)(400×)

圖4 小鼠腎臟組織HE染色結(jié)果(400×)

圖5 小鼠腎臟組織免疫復(fù)合物(IC)的沉積(400×)

在血清中檢測(cè)出自身抗體是診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的重要依據(jù)，臨床上把血清中抗dsDNA抗體和ANA的檢出視為診斷狼瘡腎炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]。患者體內(nèi)的抗dsDNA抗體含量與疾病的活動(dòng)正相關(guān)，可作為療效評(píng)估的指標(biāo)[15]。模型組小鼠末次注射14 d時(shí)抗dsDNA抗體陽(yáng)性率為20%，28 d時(shí)達(dá)到50%；而ANA在14 d時(shí)的陽(yáng)性率為70%，28 d時(shí)升至90%?？贵w干預(yù)組未檢測(cè)出抗dsDNA抗體，ANA陽(yáng)性率和熒光強(qiáng)度均降低。

紅斑狼瘡產(chǎn)生大量的自身抗體后，會(huì)大量沉積在腎小球基底膜，造成腎小球功能異常，引起狼瘡腎炎。12周時(shí)小鼠腎臟組織病理切片HE染色結(jié)果顯示，模型組部分腎小球體積代償性增大，腎小球大小不一；腎小球血管襻和腎臟小血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小球囊腔厚薄不均一，狹窄，閉塞；部分腎小球甚至可見到新月體。而抗體干預(yù)組僅出現(xiàn)少量腎小球體積輕微增大，腎小球囊腔厚薄略微不均一，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理?yè)p傷情況得到了很大改善。免疫熒光結(jié)果可見，抗體干預(yù)組沉積在腎小球毛細(xì)血管襻附近的免疫復(fù)合物的熒光大小和亮度均小于模型組。結(jié)果表明，干預(yù)后免疫復(fù)合物在腎小球的沉積大大減少，腎小球的組織形態(tài)得到一定程度的恢復(fù)，病變的腎小球功能也得到了一定改善。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)尿蛋白、免疫學(xué)、血清學(xué)及病理學(xué)等指標(biāo)動(dòng)態(tài)多角度分析，說(shuō)明運(yùn)用B7-1嵌合抗體阻斷B7-CD28共刺激信號(hào)通路，可減少自身抗體的生成，減少免疫復(fù)合物在腎臟的沉積，對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎腎臟的病理?yè)p傷起到了一定程度的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。但其分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析探討。隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，阻斷共刺激分子和基因工程抗體的運(yùn)用，將會(huì)部分替代現(xiàn)行的毒副作用較大的糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療方案，為紅斑狼瘡的治療提供特異、高效、低毒的選擇[16]。

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ImmuneinterventioneffectofB7-1chimericantibodyonlupusnephritisofchronicgraft-hostdisease(cGVHD)mice

ZHU Ying1,WANG Jing2a,SHEN Li-jun2b,WANG Zhi-yao2c,YAN Tian-ming2c,WANG Yu-yu2c,QIU Yu-hua2c

(1.Center for Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Soochow Hospital,Suzhou 215006,China;2.a.Laboratory Animal Center,b.Institutes of Biology and Medical Sciences,c.Department of Immunology,Soochow University,Suzhou 215006,China)

ObjectiveTo study the immune intervention effect of B7-1 chimeric antibody on lupus nephritis on the basis of the use of chronic graft-host disease (cGVHD) mice lupus nephritis model and its biological identification.Methods6～8 weeks aged female (C57BL/6×BALB/c)BCF1 mice were randomly divided into four groups.Each mouce in model group was intravenously injected by 100 μL orbital veins 107on the 0,3rd,7th and 11th day.Each mouse in antibody treatment group was injected B7-1 chimeric antibody by 100 μL orbital vein 200 μg on the 1st,3rd,5th,8th,15th,30th and 60th day respectively,while each mouse in CTX treatment group was injected 100 μL CTX 2.5 mg on the 1st,3rd,5th,8th and 15th day respectively.The urine protein,anti-dsDNA antibody and ANA content were analyzed at each time point.After the mice were sacrificed on the twelfth weeks,the HE staining of kidney tissue and immune complexes (IC) deposition was observed.ResultsAt the 12 th week,100% of the model mice were detected proteinuria(++～++++) while only 30% of the antibody treatment group mice(+～++).At the 12 th week,the anti-dsDNA antibody positive rate in antibody treatment group were zero while the model group were 50%,ANA positive rate were 40% while the model group were 90%;HE staining and microscopic observation,only part of the antibody treatment group appeared glomerular swelling,less lymphocyte infiltration and crescent generation;direct immunofluorescence have seen less IC deposited in glomerular vascular loops,the fluorescence area and brightness were weaker than the model group.ConclusionB7-1 chimeric antibody can decrease the generation of autoantibodies and IC,decrease the pathological damage of lupus nephritis by blocking or weakening the B7/CD28 co-signaling pathways,which suggested that self-developed B7-1 human-mouse chimeric antibody can prevent and control lupus nephritis.

B7-1 human-mouse chimeric antibody;ANA;Immune intervention;cGVHD;Lupus nephritis

2017-06-19

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)a.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，b.生物醫(yī)學(xué)研究院，c.醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，江蘇 蘇州 215006

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373236)

10.14053/j.cnki.ppcr.201712005