王 榮，劉 莉，張玲莉

·論著·

五味子多糖對原代大鼠肝細胞氧化應激損傷的保護機制研究

王 榮a，劉 莉b，張玲莉c

目的探討五味子多糖對原代大鼠肝細胞氧化應激的保護效應，并對其作用機制進行研究。方法體外培養(yǎng)原代大鼠肝細胞，分為空白對照組、H2O2誘導組、H2O2+低劑量五味子多糖組、H2O2+中劑量五味子多糖組、H2O2+高劑量五味子多糖組；CCK-8試劑檢測大鼠肝細胞相對存活率，相關(guān)試劑盒檢測NO、MDA含量，Western blot檢測大鼠肝細胞中P67-phox、P47-phox、SOD1、HO-1、Rac1、p-Rac1蛋白表達水平。結(jié)果與H2O2誘導組相比，不同濃度五味子多糖可明顯提升大鼠肝細胞的存活率(P<0.05)；與H2O2誘導組相比，不同劑量五味子多糖可明顯抑制細胞中NO、MDA的生成(P<0.05)；Western blot檢測顯示，不同劑量五味子多糖可明顯促進抗氧化蛋白HO-1、SOD1表達，抑制促氧化蛋白P67-phox、P47-phox的表達，并且五味子多糖顯著抑制Rac1的磷酸化(P<0.05)。結(jié)論五味子多糖可明顯改善大鼠肝細胞氧化應激損傷，其作用機制可能與抑制Rac1的磷酸化有關(guān)。

五味子多糖；大鼠；肝細胞；氧化應激

0 引言

五味子為木蘭科五味子屬和南五味子屬植物的泛稱，全世界約有50多種，主要分布在東亞地區(qū)[1]。五味子發(fā)揮功效的成分主要有木質(zhì)素、揮發(fā)油、多糖和全氮及氨基酸，目前對五味子的藥理學作用研究主要集中在肝臟及心血管的保護作用，抗驚厥及改善心肌營養(yǎng)和功能等方面[2]。五味子多糖是從五味子中分離提純得到的多糖類生物活性物質(zhì)，具有明顯的抗氧化、抗凋亡的作用，五味子多糖能通過增加細胞內(nèi)抗氧化劑含量及各種抗氧化酶的活性，增強線粒體的功能和結(jié)構(gòu)的完整性，對心臟、大腦、肝臟、腎臟等組織或細胞損傷均具有一定的保護作用[3-6]。但有關(guān)五味子多糖對肝細胞氧化應激損傷的保護作用機制尚未見相關(guān)報道。

本實驗以體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞為研究對象，利用H2O2制備氧化應激損傷模型，觀察五味子多糖對氧化損傷大鼠肝細胞的保護作用，為臨床肝臟藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 五味子多糖(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：88415-35-4，≥99%)；DMEM高糖培養(yǎng)基(上海吉諾公司)、胎牛血清(四季青生物有限公司)、胰蛋白酶(上海吉諾公司)；CCK-8試劑盒(上海海聯(lián)生物有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：P0023S-09)；MDA、NO檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；一抗稀釋液(上海谷歌公司)；ECL顯色液(Sigma公司)；β-actin、P67-phox、P47-phox、SOD1、HO-1、Rac1、p-Rac1一抗均購自美國Abcam公司；二抗羊抗兔IgG購自上海谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 單人超凈工作臺(上海蘇靜實業(yè)有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(上海印溪儀器儀表有限公司)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(美國BD，F(xiàn)ACS AriaⅢ)；HD-3000凝膠成像儀(上海上天精密儀器有限公司)；7230G數(shù)顯可見紫外分光光度計測定儀(上海菁華)。

1.3 原代細胞培養(yǎng)[7]采用改良原位兩步非循環(huán)灌流法及多次過濾低速離心法分離原代大鼠肝細胞。采用DMEM完全培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清、1%的105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、160 U/L胰島素)培養(yǎng)原代大鼠肝細胞。重懸調(diào)整肝細胞密度后，以1×106個細胞/孔接種于鋪有鼠尾膠原的6孔板上培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后換液，用DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，之后每1 d換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.4 大鼠肝細胞存活率檢測 取對數(shù)生長期的大鼠肝細胞，清洗、消化、重懸細胞后，以5×103/孔接種至96孔板中，每組實驗設置6個復孔，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。低(20 μg/mL)、中(40 μg/mL)、高(80 μg/mL)劑量五味子多糖和H2O2共同作用肝細胞，加入含藥物的終體積為100 μL/孔。五味子多糖作用24 h后，吸干舊培養(yǎng)基，每孔加入含CCK-8試劑10 μL的新鮮培養(yǎng)基100 μL。待CCK-8試劑與細胞作用1 h后，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度OD值，并計算肝細胞相對存活率。

1.5 MDA、NO含量檢測 取對數(shù)生長期的大鼠肝細胞，清洗、消化、重懸細胞后，以5×105/孔接種至6孔板中，每組實驗設置6個復孔，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。低、中、高劑量五味子多糖和H2O2共同作用肝細胞，加入含藥物的終體積為1 mL/孔。藥物作用24 h后，收集細胞上清培養(yǎng)液及細胞，將細胞裂解成勻漿液，按照試劑說明書測定MDA、NO含量。

1.6 蛋白表達水平檢測 取對數(shù)生長期的大鼠肝細胞，清洗、消化、重懸細胞后，以5×105/孔接種至6孔板中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。低、中、高劑量五味子多糖和H2O2共同作用細胞，加入含藥物的終體積為1 mL/孔。藥物作用24 h后，收集細胞、裂解、測定蛋白濃度。細胞裂解液中加入上樣緩沖液，100 ℃加熱煮沸10 min。電泳時，每孔上樣蛋白量為40 μg，在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離，濃縮膠電泳分離時，電壓設置為70 V，分離膠電泳時，電壓設置為120 V；分離完成后在275 mA電流轉(zhuǎn)膜60 min；再將NC膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗孵育過夜后，二抗常溫下孵育1 h，洗膜3次，顯色成像。

2 結(jié)果

2.1 各組原代大鼠肝細胞相對存活率的變化 五味子多糖孵育原代大鼠肝細胞24 h后，低、中、高濃度五味子多糖對細胞存活率的影響見圖1。H2O2刺激細胞可明顯降低細胞的相對存活率，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而經(jīng)過低、中、高劑量五味子多糖作用后，細胞相對存活率較H2O2誘導組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著五味子多糖劑量上升，細胞相對存活率顯著升高，說明五味子多糖呈濃度依賴性改善H2O2誘導大鼠肝細胞氧化應激損傷。

圖1 五味子多糖對大鼠肝細胞增殖的影響

注：1.空白對照組，2.H2O2誘導組，3.H2O2+低劑量五味子多糖組，4.H2O2+中劑量五味子多糖組，5.H2O2+高劑量五味子多糖組。與空白對照組比較，*P<0.05；與H2O2誘導組比較，#P<0.05

2.2 大鼠肝細胞培養(yǎng)液中NO、MDA含量的變化 NO、MDA檢測試劑盒對大鼠肝細胞氧化應激產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，H2O2處理組細胞中 NO、MDA含量均顯著高于空白對照組(P<0.05)。經(jīng)過高、中、低3種濃度五味子多糖作用大鼠肝細胞后，發(fā)現(xiàn)NO、MDA含量較H2O2處理組細胞明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著五味子多糖濃度增加顯著性增強，呈現(xiàn)出濃度依賴性。說明五味子多糖可以抑制氧化應激產(chǎn)物NO、MDA的產(chǎn)生，起到保護大鼠肝細胞氧化應激損傷的作用。

圖2 不同組別間細胞氧化應激產(chǎn)物的比較

注：1.空白對照組，2.H2O2誘導組，3.H2O2+低劑量五味子多糖組，4.H2O2+中劑量五味子多糖組，5.H2O2+高劑量五味子多糖組。與空白對照組比較，*P<0.05；與H2O2誘導組比較，#P<0.05

2.3 大鼠肝細胞中P67-phox、P47-phox、SOD1、HO-1表達水平的變化 結(jié)果表明，H2O2處理組細胞中促氧化蛋白P67-phox和P47-phox表達水平均顯著高于空白對照組，而抗氧化蛋白HO-1及SOD1表達水平均低于空白對照組(P<0.05)。經(jīng)3種濃度五味子多糖作用大鼠肝細胞后，P67-phox、P47-phox表達水平降低，HO-1、SOD1表達水平升高，與H2O2誘導組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著五味子多糖劑量增加顯著性增強，表現(xiàn)出濃度依賴性。見圖3、圖4。

圖3 五味子多糖對細胞P67-phox、P47-phox、SOD1、HO-1表達水平的影響

2.4 大鼠肝細胞中Rac1磷酸化水平的變化 H2O2誘導組中Rac1磷酸化水平顯著高于空白對照組(P<0.05)，說明H2O2可誘導Rac1磷酸化導致氧化應激。不同劑量五味子多糖處理細胞后，p-Rac1水平顯著低于H2O2誘導組，(P<0.05)，并表現(xiàn)出濃度依賴性。見圖5。

圖4 各組P67-phox、P47-phox、SOD1、HO-1表達水平比較

圖5 五味子多糖對Rac磷酸化的影響

3 討論

細胞內(nèi)多種氧化還原反應的代謝產(chǎn)物會產(chǎn)生活性氧(ROS)，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除保持著動態(tài)平衡狀態(tài)，以保證內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在多種體內(nèi)外損傷因素的作用下，活性氧的生成大于自身的清除，進而產(chǎn)生氧化應激，活性氧在體內(nèi)增多并參與氧化生物大分子的形成，誘發(fā)基因突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，進而損傷溶酶體、線粒體等細胞器，最終引起細胞的氧化應激損傷[6,8]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激損傷常常導致肝纖維化的發(fā)生，而且抗氧化劑可以減慢或阻止肝纖維化的發(fā)展[9-10]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子多糖可以改善H2O2誘導的大鼠肝細胞氧化應激損傷，可通過促進肝細胞的增殖、抑制氧化應激產(chǎn)物MDA、NO的生成來達到作用效果。

P67-phox、P47-phox為促氧化的NADPH氧化酶的兩個亞基，SOD1、HO-1是抗氧化發(fā)生的超氧化物歧化酶，其在氧化應激發(fā)生過程中有著重要的作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子多糖可以顯著降低P67-phox及P47-phox蛋白的表達水平，而顯著升高SOD1及HO-1蛋白表達水平[11-12]。三磷酸酶(Rac1)在NADPH氧化酶的活化過程中起著重要的作用，Rac1的磷酸化可以激活氧化應激通路，導致組織氧化應激損傷的發(fā)生[13]。本實驗也發(fā)現(xiàn)，五味子多糖可以抑制Rac1的磷酸化，起到抗氧化應激的作用。綜上所述，五味子多糖可能通過抑制Rac1的磷酸化，降低P67-phox、P47-phox蛋白的表達，促進SOD1及HO-1蛋白表達，抑制氧化應激產(chǎn)物NO、MDA的產(chǎn)生，達到抗氧化應激的作用。

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Protectivemechanismofschizandraepolysaccharideforoxidativestressinrathepatocytes

WANG Ronga,LIU Lib,ZHANG Ling-lic

(a.Nursing Department,b.Department of Thoracic Surgery,c.Department of Pharmacy,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of schizandrae polysaccharide for oxidative stress in rat hepatocytes,and study the molecular mechanism of schizandrae polysaccharide in inhibiting oxidative stress.MethodsPrimary rat hepatocytes were culturedinvitro,and the rat hepatocytes were divided into five groups:control group,H2O2-induced group,and low,medium and high-dose schizandrae polysaccharide groups.The effect of schizandrae polysaccharide on the relative survival rate of hepatocytes was observed using CCK-8 assay.The levels NO and MDA were measured by related kits.The expression levels of P67-phox,P47-phox,SOD1,HO-1,Rac1 and p-Rac1 in cells were determined by Western blot.ResultsCompared with H2O2-induced group,schizandrae polysaccharide could significantly improve the survival rate of hepatocytes (P<0.05) and inhibit the levels of NO and MDA in hepatocytes (P<0.05);the expression levels of HO-1 and SOD-1 in all schizandrae polysaccharide groups were significantly increased (P<0.05),while the levels of P67-phox and P47-phox were significantly decreased (P<0.05).Moreover,the phosphorylation levels of Rac1 were significantly decreased in all schizandrae polysaccharide groups (P<0.05).ConclusionSchizandrae polysaccharide can significantly inhibit the oxidative stress injury of hepatocytes and its underlying mechanism may involve suppressing the phosphorylation of Rac1.

Schizandrae polysaccharide;Rat;Hepatocytes;Oxidative stress

2017-04-13

武漢大學人民醫(yī)院a.護理部，b.胸外科，c.藥學部，武漢 430060

10.14053/j.cnki.ppcr.201712001