吳樣明，邵 堅(jiān)，孫函靜，甘 俠，張品南，謝有發(fā)，季巧遇，2*

(1.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)植物，為常綠小喬木或灌木，是我國一種重要的油料植物[1]。油茶枯餅又稱茶餅、茶粕、餅粕等，是油茶籽經(jīng)過壓榨出油后剩余的殘?jiān)?，其量約為茶油產(chǎn)量的3倍。油茶籽仁含油率約40%～45%，目前多采用95#螺旋榨油機(jī)，出油效率約93%～95%[2]。油茶皂苷是從油茶枯餅中提取出來的五環(huán)三萜類混合物[3]，是一種性能優(yōu)良的非離子型天然表面活性劑，并具有溶血性、鎮(zhèn)痛、抗菌、免疫抑制等多種生物活性[4-9]。但目前對(duì)油茶皂苷的提取效率普遍不高，目前，我國油茶種植面積約有300萬hm2，油茶籽年產(chǎn)量約為100萬噸，年產(chǎn)茶油約26萬噸。油茶栽培歷史悠久，油茶產(chǎn)業(yè)作為江西省林業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，全省油茶總面積75萬hm2，目前全省油茶種植面積和茶油產(chǎn)量均居全國第二位。油茶枯餅里面含有較多的油茶皂苷、茶多糖和蛋白質(zhì)等成分，由于油茶枯餅中含有皂苷，味苦且有毒性，目前絕大部分茶餅被用作清塘劑、肥料和燃料，甚至廢棄，造成了極大的資源浪費(fèi)。本研究主要通過對(duì)油茶枯餅中油茶皂苷提取工藝的優(yōu)化進(jìn)行研究，以提高油茶產(chǎn)業(yè)農(nóng)副產(chǎn)品的資源利用率，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)意義和良好的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

油茶枯餅藥材來源于江西省贛州市上猶縣安和鄉(xiāng)。主要試劑：油茶皂苷對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)鑒定其純度為98%)；香蘭素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；硫酸(江西同盟試劑化工廠，分析純)；無水乙醇(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司，分析純)；氫氧化鈉(粒狀)(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司，分析純)；鹽酸(西隴化工股份有限公司，分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-1750型紫外分光光度計(jì)(島津國際貿(mào)易有限公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子萬用爐(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-500B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER AE240電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 油茶皂苷含量測定方法

采用紫外-可見分光光度法測定提取液中油茶皂苷的提取率。

2.1.1 最大吸收波長選定 用紫外-可見分光光度計(jì)在450～700 nm處對(duì)油茶皂苷對(duì)照品進(jìn)行掃描，選取最大吸收波長作為油茶皂苷的檢測波長。精確稱取油茶皂苷對(duì)照品0.5 g，加入蒸餾水定容至50 mL，量取0.5 mL后加水定容至25 mL，取0.5 mL加入香草醛-濃硫酸顯色劑(0.5 mL的8%香草醛-無水乙醇加入4 mL 77%濃硫酸)于60 ℃加熱15 min后，在冷水中冷卻3 min，以顯色劑為參比溶劑，用1 cm比色皿在可見光區(qū)掃描，在550 nm處有最大吸收，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符合(550±2 nm)，見圖1。

圖1 油茶皂苷紫外圖譜

2.1.2 顯色劑穩(wěn)定性考察 精確量取0.000 2 g/mL的油茶皂苷對(duì)照品溶液0.5 mL，加入香草醛-濃硫酸顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，冷水中冷卻后，每隔5 min測其吸光度A，A1=0.191 7，A2=0.191 7，A3=0.191 6，A4=0.191 5，A5=0.191 1，A6=0.190 4，其RSD%<5%，顯色劑表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱取油茶皂苷對(duì)照品0.5 g，加水定溶至50 mL，分別取0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，加水定容至25 mL，再分別取0.5 mL測其吸光度，以吸光度(A)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量百分比濃度C(g∕mL)，求回歸方程。濃度在0.000 2 g/mL～0.001 g/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，見圖2。

圖2 油茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

油茶皂苷的提取率的計(jì)算公式：

油茶皂苷提取率(%)=油茶皂苷的質(zhì)量濃度C(g/mL)×定容體積(mL)×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量(g)×100%

2.2 油茶皂苷提取工藝的單因素考察

本實(shí)驗(yàn)采用水為溶劑來提取油茶皂苷，考察不同因素對(duì)油茶皂苷提取效果的影響。水提法對(duì)油茶皂苷的提取效果的影響因素包括：提取溶劑的pH值，提取溫度，提取時(shí)間和液料比。

2.2.1 提取溫度的考察 分別精確稱取枯餅20.0 g，加入80 mL水，配制成溶液(pH=9.0)，分別在60 ℃﹑70 ℃、80 ℃﹑90 ℃﹑100 ℃下提取3次，每次提取30 min，提取液調(diào)整為pH=7.0后蒸干，稱取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精確量取0.25 mL定容到10 mL，測其吸光度A。見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)油茶皂苷提取率的影響

2.2.2 溶劑pH考察 分別精確稱取油茶枯餅20.0 g，加入80 mL水，配成pH=5.0﹑6.0﹑7.0﹑8.0﹑9.0、10.0的溶液，于60 ℃水浴下提取3次，每次提取60 min，提取液調(diào)整至pH=7.0后蒸干，稱取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精確量取0.25 mL定容至10 mL，測其吸光度A。結(jié)果見圖4。

2.2.3 提取時(shí)間的考察 分別精確稱取20.0 g枯餅，加入80 mL水，在pH=9.0，溫度為80 ℃的條件下分別提取40 min﹑60 min﹑80 min﹑100 min和120 min，每個(gè)時(shí)間段提取3次，提取液調(diào)整為pH=7.0后蒸干，稱取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精確量取0.25 mL定容到10 mL，測其吸光度A。見圖5。

圖4 pH對(duì)油茶皂苷提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)油茶皂苷的提取率的影響

2.2.4 液料比的考察 分別精確稱取20.0 g枯餅，按照1∶4﹑1∶5﹑1∶6﹑1∶7﹑1∶8加入水，在pH=9.0，溫度為80 ℃的條件下提取3次，每次提取80 min，提取液調(diào)整為pH=7.0后蒸干，稱取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精確量取0.25 mL定容到10 mL，測其吸光度A。見圖6。

圖6 液料比對(duì)油茶皂苷提取率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取 在綜合單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以溶液pH、提取溫度、提取時(shí)間和液料比為自變量，根據(jù)Box-Behnken Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)水平與代碼，見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

2.3.2 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 精確稱取油茶枯餅20.0 g，按表2所列試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，其中3、4、6、14、20為中心實(shí)驗(yàn)，用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，其他是析因?qū)嶒?yàn)。采用Design-Expert.V8.0.6軟件處理得響應(yīng)面分析結(jié)果，見表3和圖7-圖10。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 響應(yīng)面回歸模型的優(yōu)化

經(jīng)過Design-Expert.V8.0.6軟件的分析和計(jì)算得出的編碼自變量X1、X2、X3、X4的二次多項(xiàng)回歸方程為：

對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)R2=81.86%，P<0.01，說明響應(yīng)值(提取率)的變化有81.86%來源于所選變量，即提取溫度、溶劑pH、提取時(shí)間和液料比。證明此回歸模型顯著，擬合程度好，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用此回歸方程確定最佳提取工藝條件。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(表6)，表明提取溫度X1、溶劑pHX2、液料比X4及其二項(xiàng)式X12對(duì)油茶枯餅中油茶皂苷提取率有顯著影響；其他變量的影響均不顯著(P>0.05)。依據(jù)系數(shù)估計(jì)值X1=-1.24、X2=-0.87、X3=0.37、X4=1.35可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為液料比>提取時(shí)間>溶劑pH>提取溫度。

表3 回歸方程方差分析

圖7 殘差的正態(tài)圖

圖8 Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面與等高線

圖9 Y=f(X1，X3)的響應(yīng)面與等高線

圖10 Y=f(X1，X4)的響應(yīng)面與等高線

2.5 模型的修正與驗(yàn)證

經(jīng)軟件求解回歸方程后所得的最佳提取方案為：提取溫度75.99 ℃，溶劑pH=7，提取時(shí)間99.92 min，液料比為6.26，在此條件下油茶皂苷提取率為21.27%。

考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最優(yōu)提取條件修正為：提取溫度76 ℃，溶劑pH=7，提取時(shí)間100 min，液料比為6。

根據(jù)修正后的優(yōu)化工藝進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，結(jié)果見表4。油茶枯餅中油茶皂苷的平均提取率為21.27%，RSD為1.08，與預(yù)測值相對(duì)誤差為0.94%，表明與回歸方程所預(yù)測理論值相吻合，進(jìn)一步說明此方程與實(shí)際情況擬合程度好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

3 結(jié)論

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)