沈彥 苗德升 張中堂

摘要：目的 驗證克倫特羅膠體金快檢試劑法的適用性。方法 采用LC-MS方法與克倫特羅膠體金檢測市售畜產(chǎn)品中克倫特羅殘留量，對比快檢方法與實驗室傳統(tǒng)儀器檢測法測定的結(jié)果，分析膠體金試劑盒的適用性。結(jié)果 通過對90批次的豬牛羊肉中克倫特羅殘留量的檢測，膠體金快速檢測法與LC-MS測定的結(jié)果進行分析比較，結(jié)果一致性達92%。結(jié)論 克倫特羅膠體金快速檢測法基本可用于畜產(chǎn)品中克倫特羅殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞：克倫特羅；膠體金；快檢；驗證

民以食為天，食以安為先，食品是人類賴以生存和發(fā)展的最基本的物質(zhì)條件。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人民生活水平提高，食品安全問題受到廣泛的關(guān)注。食品安全不僅關(guān)系到民生，還涉及到我國社會的長治久安。然而近年來，我國食品頻頻爆發(fā)出質(zhì)量問題，一些不良企業(yè)通過各種方式和渠道，生產(chǎn)出問題食品流通于市面，給人們的健康帶來危害。問題食品經(jīng)過監(jiān)管部門的抽樣，到檢測部門的法定方法檢測，再到執(zhí)法部門依據(jù)相關(guān)法規(guī)判罰，需要一定的周期時間完成，再加上傳統(tǒng)的實驗室檢測方法比較繁瑣，耗時，一定程度上增加了食品的檢驗周期，大大減弱了流程的時效性。對監(jiān)督工作帶來許多不便，因此催生出了快檢技術(shù)。快檢技術(shù)具有操作簡單，快速，省時，省力。目前市場上快檢試劑盒，快檢儀器主要用于食品的初步的快速篩查，膠體金快檢法是否能夠準確的篩查出陽性樣品，假陽性率多少，本實驗將采用實驗室規(guī)定的《GB/T22286-2008動物源性食品中-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》LC-MS法對樣本進行檢測，檢測結(jié)果與膠體金快檢法進行對比驗證。

1 膠體金快檢法

1.1 產(chǎn)品簡介

本產(chǎn)品用于快速檢測組織樣本中克倫特羅殘留，適用于各類企業(yè)、檢測機構(gòu)、監(jiān)督部門的現(xiàn)場快速檢測。

1.2 檢測限（ug/㎏=ppb）

1ug/㎏

1.3 適用范圍

豬、牛、羊肉（精瘦肉為宜）

1.4 樣品處理

1.4.1 將去脂、絞碎的精肉組織樣本4克以上，裝入離心管中，擰緊管蓋（勿讓水進入離心管中），在90℃以上水浴鍋中加熱10分鐘（肉熟透為準）立即取出樣品滲透液。

1.4.2 樣品滲出液冷卻至室溫（20～25℃）后，待測。

1.5 檢測步驟

1.5.1 使用前將測試卡和待測樣本溶液恢復至室溫（20～25℃）。

1.5.2 拆開包裝袋，取出檢測卡，并在一小時內(nèi)使用。

1.5.3 將檢測卡平放，用滴管吸取待檢樣品溶液，垂直滴加4滴（約120ul）于加樣孔中，加樣后開始計時。

1.5.4 結(jié)果應在5分鐘讀取，其他時間判讀無效。

1.6 結(jié)果判斷

1.6.1 陰性（-）：T線顯色比C線顯色深或一樣深，表示樣品中待檢測物質(zhì)濃度低于檢測限，或不含待測物質(zhì)。

1.6.2 陽性（+）：T線顯色比C線顯色淺，或T線無顯色，則表示樣品中待檢測物質(zhì)濃度高于檢測限。

1.6.3 無效：質(zhì)控線C線未顯色，表明操作過程不正確或檢測卡已失效。

1.7 儀器判讀

將待判讀檢測卡插入儀器，選擇對應項目和批號進行檢測，根據(jù)儀器顯示結(jié)果進行判讀。

1.8 測定結(jié)果

通過膠體金試劑檢測卡對90批次樣品進行快速檢測，陽性樣品6批次，陰性樣品84批次。（其中有4批次假陽性樣品，通過再次快檢試驗，驗證為陰性）。

2 LC-MS法

2.1 樣品制備

2.1.1 提取

稱取2g（精確到0.01 g）經(jīng)搗碎的樣品與于50ML離心管中，加入8ml乙酸鈉緩沖液，充分混勻，再加50ul-葡萄糖醛甙酶，混勻后，37℃水浴水解12h.添加100 ul 10ng/ml的內(nèi)標工作液克倫特羅-D9于待測樣品中。加蓋置于水平振蕩器震蕩15分鐘，離心10分鐘，（5000r/min），取4ml上清液加入0.1mol/l高氯酸溶液5ml混合均勻，用高氯酸調(diào)節(jié)PH值在1±0.3。5000r/min離心10min后，將全部上清液轉(zhuǎn)移到50 ML離心管中，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值到11。加入10Mlb飽和氯化鈉溶液和10mL異丙醇+乙酸乙酯（6+4）混合溶液，充分提取，在5000r/min下離心10min。轉(zhuǎn)移全部有機相，在40℃水浴下用氮氣將其吹干。加入5mL乙酸鈉緩沖液，超聲混勻，使殘渣充分溶解備用

2.1.2 凈化

將陽離子交換小柱連接到真空過柱裝置。將上述殘渣溶液上柱，依次用2ml水、2ml 2%甲酸水溶液和2ml甲醇洗滌柱子并徹底抽干，最后用2ml的5%氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測組分。洗脫液在40℃水浴下氮氣吹干。準確加入200 ul 0.1%甲酸/水-甲醇溶液（95+5），超聲混勻。將溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，15000r/min離心10min。上清液供LC-MS測定。

2.2 樣品檢測

色譜柱：C18柱；流動相：0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈（梯度洗脫）；流速：0.2ml/min；柱溫：30℃；離子源：ESI（+）；質(zhì)譜條件優(yōu)化到最優(yōu)靈敏度。按照優(yōu)化條件測定樣品和標準工作溶液，以色譜峰面積按內(nèi)標法定量。

2.3 測定結(jié)果

通過LC-MS對90批次樣品進行分析檢測，陽性樣品5批次，陰性樣品批次數(shù)85批次。

3 膠體金快檢法與LC-MS法驗證結(jié)果比較

通過膠體金快速檢測90批次樣品，結(jié)果表明該快檢法適用于畜產(chǎn)品中克倫特羅殘留量的快速檢測，且與LC-MS法測定的結(jié)果基本相符，陽性重合率達到98.86%，可以初步篩查出超標樣品?？藗愄亓_膠體金試劑盒快檢法基本可用于畜產(chǎn)品中克倫特羅的檢測。

4 討論

在食品檢驗檢測過程中，采用快檢技術(shù)能促進食品質(zhì)量的提升，保障市場中食品的質(zhì)量，大大地提高了監(jiān)管部門執(zhí)法的時效性。膠體金快檢法采用競爭抑制免疫層析技術(shù)的原理，實驗過程中樣品提取時間，反應溫度，提取液的量受環(huán)境等不確定因素的影響，會使實驗結(jié)果失真，出現(xiàn)假陽性，因此，為更好的發(fā)揮快速檢測作用，把控食品中非法添加物的殘留，有必要進一步提高和改進實驗條件和試驗人員的技能，對快件技術(shù)能夠熟練的運用，使其能夠成為打擊假劣產(chǎn)品的重要武器，為人民的飲食安康保駕復航。

參考文獻：

[1]桑圓圓，柴麗娜，等。酶抑制法檢測4種辛辣蔬菜農(nóng)藥殘留量假陽性消除的研究〔J〕.中國農(nóng)學通報，2009，25（11）；60-64

[2]克倫特羅膠體金快速檢測使用說明書。

[3]《GB/T 22286-2008 動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》