摘要：甲醇酵母細(xì)胞胞內(nèi)蛋白敦化可以選擇使用堿溶方法、離心方法、破壁方法、酸沉方法。主要研究的內(nèi)容是甲醇酵母細(xì)胞胞內(nèi)蛋白純化額條件。在研究之后得到以下結(jié)果：相比較生物酶解處理方法、熱堿處理方法以及高壓均質(zhì)處理方法，熱堿與高壓均質(zhì)聯(lián)合處理法可以從根本上提升細(xì)胞破壁效率。在100 MPa壓力、PH值等于10.0的條件下進(jìn)行兩個(gè)小時(shí)的60℃熱處理，并且完成三次均質(zhì)操作，那么其得到的細(xì)胞破壁率可以達(dá)到87.60%。如果PH等于4.5，在破壁之后，可以得到最大的上清液蛋白沉淀量，處理之后得到的粗蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到82.5%（在純化甲醇蛋白中），可以取得非常顯著的、理想的甲醇酵母細(xì)胞胞內(nèi)蛋白純化效果。

關(guān)鍵字：甲醇酵母；細(xì)胞；胞內(nèi)蛋白純化

通過(guò)發(fā)酵的形成，將以甲醇、磷酸等作為培養(yǎng)基的甲醇蛋白進(jìn)行處理，單細(xì)胞菌體是甲醇酵母細(xì)胞的主要部分，在完成再一次提煉的基礎(chǔ)上得到單細(xì)胞蛋白部分。在完成甲醇酵母細(xì)胞提取的基礎(chǔ)上，得到的是完全無(wú)毒的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品，相對(duì)于其他植物性原料來(lái)說(shuō)，存在的氨基酸含量非常的豐富，所以這是一種具備非常豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品[1]。本次研究主要利用的是堿溶方法、離心方法、破壁方法、酸沉方法完成甲醇蛋白粗品經(jīng)過(guò)的制取，最后實(shí)現(xiàn)甲醇蛋白的鈍化，主要研究的是甲醇酵母細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì)純化的正確途徑，為后期有效的利用甲醇蛋白提供有效的基礎(chǔ)前提[2]。

1選擇材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料的選擇

首先是原料的備制跟試劑的備制[3]。于廣西南寧龐博生物工程有限公司購(gòu)取酵母破壁酶試劑；甲醇蛋白粗品是自制的，甲醇蛋白粗品成分，詳細(xì)成分如下：粗蛋白質(zhì)占比例為50.00%；粗脂肪占比例為11.50%；粗纖維占比例為7.40%；水分占比例為18.50%；粗灰分占比例為12.60%。剩下其他的試劑都是分析純類別。

其次是儀器的備制與設(shè)備的備制。在意大利的GEA Nrio公司購(gòu)進(jìn)BD-1A-70冷凍干燥機(jī)以及NS 1001L高壓均質(zhì)機(jī)，同時(shí)購(gòu)進(jìn)Q/SGYM1008電子天平。繼而于梅特勒托利多公司購(gòu)進(jìn)Delta 320酸度計(jì)。最后購(gòu)進(jìn)SHA-B水浴恒溫振蕩器、TDL-5A離心機(jī)以及K-S24恒溫水浴鍋[4]。

1.2實(shí)驗(yàn)操作方法

1.2.1測(cè)定細(xì)胞破壁率大小

在處理之前跟處理之后，分別取1ml的甲醇蛋白細(xì)胞懸液，對(duì)甲醇蛋白細(xì)胞懸液進(jìn)行顯微鏡觀察操作，操作之后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)完整形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)數(shù)要求是，每一樣品完成五次計(jì)數(shù)，之后計(jì)算得到其平均值大小。在破壁之前跟之后，細(xì)胞破壁率指的就是，在破壁前細(xì)胞數(shù)中，具有完整形態(tài)細(xì)胞數(shù)之差的比例大小使用“%”表示。

1.2.2測(cè)定蛋白釋放量大小

在完成破壁處理之后，甲醇蛋白粗品干重跟上清液中蛋白質(zhì)總量的比例就是蛋白釋放量大小。

1.2.3甲醇蛋白酸的沉純化

在選擇滿足甲醇蛋白細(xì)胞破壁處理方法的基礎(chǔ)上，取五份25%甲醇蛋白粗品溶液，每一份為500 m L，在完成處理之后，對(duì)其進(jìn)行離心操作，完成上清液的收集，之后使用鹽酸，將上清液PH值調(diào)節(jié)，促使其達(dá)到：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，之后完成二十分鐘的靜置操作，并且進(jìn)行離心操作，每分鐘5 000 r，離心時(shí)間為10分鐘，就可以得到蛋白沉淀。之后冷凍干燥蛋白沉淀，對(duì)其進(jìn)行稱重，之后按照計(jì)算的原則完成蛋白沉淀中粗蛋白質(zhì)含量大小的計(jì)算。

2結(jié)果

2.1對(duì)甲醇蛋白細(xì)胞破壁均質(zhì)次數(shù)的影響

均質(zhì)處理甲醇蛋白粗品溶液，基于100 MPa條件以及PH等于 9.0條件下，假設(shè)為1次～5次的均質(zhì)次數(shù)，詳細(xì)如下圖1所示。

分析上圖得到，完成三次均質(zhì)之后，超過(guò)80%的細(xì)胞都可以實(shí)現(xiàn)有效的破壁，并且還會(huì)不斷的增加胞內(nèi)蛋白釋放量。在實(shí)際工作中，如果存在超過(guò)三次的均質(zhì)次數(shù)，沒(méi)有辦法從根本上提升細(xì)胞破壁率以及沒(méi)有顯著提升蛋白釋放量。

2.2甲醇蛋白酸的沉純化

在不同PH下以及100 MPa跟PH等于10.0條件，3次均質(zhì)25%甲醇蛋白粗品溶液（500 m L），之后進(jìn)行離心，取得上清液蛋白沉淀量，詳細(xì)如下所示：

分析上圖得到，在PH等于4.5的時(shí)候，可以取得最大的蛋白沉淀量，可以達(dá)到51.00g最多。同時(shí)隨著PH值的不斷增加，之后呈現(xiàn)一個(gè)不斷的蛋白沉淀量降低趨勢(shì)。分析上述結(jié)果可以得到以下結(jié)論：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（從甲醇酵母細(xì)胞中提純的）大致上PH等于4.5。在進(jìn)行蛋白沉淀的過(guò)程中，只要是高于PH值的或者是低于PH下，都會(huì)存在蛋白質(zhì)損失的情況。PH如果等于4.5，在這個(gè)條件下得到的粗蛋白質(zhì)含量（純化甲醇蛋白產(chǎn)品中）可以達(dá)到82.50%，可以取得非常理想的純化效果。

3討論

綜上所述，在完成相關(guān)的分析之后，相比生物酶解處理法來(lái)說(shuō)，熱堿與高壓均質(zhì)聯(lián)合處理方法可以從根本上提升細(xì)胞破壁效率，同時(shí)高壓均質(zhì)處理法以及熱堿處理法的細(xì)胞破壁效率提升率相比熱堿與高壓均質(zhì)聯(lián)合處理方法來(lái)說(shuō)較低。本次研究取得了熱堿均質(zhì)處理的最滿意條件，那就是PH等于10.0，在60℃的環(huán)境下，完成兩個(gè)小時(shí)的熱處理，在100 MPa壓力條件下，完成3次的均質(zhì)處理，所以其細(xì)胞的破壁率會(huì)達(dá)到87.60%。如果PH值等于4.5，在破壁之后，會(huì)存在最大的上清液蛋白沉淀量，粗蛋白質(zhì)含量的所得純化甲醇蛋白中達(dá)到82.5%，可以取得非常顯著的、理想的純化效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]李素霞，袁勤生.重組羧肽酶原B甲醇酵母的構(gòu)建與分泌表達(dá)[J].食品與藥品，2008（11）：5-7.

[2]王志方，艾秀蓮，李晨華，王瑋，張偉，馮懷蓉，王成.甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（04）：222-224.

[3]黃秀東，楊紅，張高峽，李樹(shù)剛，于廷和.酶法測(cè)定甲醇酵母發(fā)酵液中甲醇濃度[J].生物技術(shù)，2001（02）：23-25.

[4]彭毅，楊希才，康良儀.影響甲醇酵母中外源蛋白表達(dá)的因素[J].生物技術(shù)通報(bào)，2000（04）：33-36.

作者簡(jiǎn)介；柳蘇玲（1991.11-）女，江西萍鄉(xiāng)人，碩士，研究方向：細(xì)胞組織與工程