王 欣，潘麗芬

(江蘇省蠶種所，江蘇無錫 214151)

家蠶微粒子病是一種對養(yǎng)蠶業(yè)具有毀滅性的疫病，對蠶種生產(chǎn)危害極大，是農(nóng)業(yè)部規(guī)定的必檢疫病，是蠶種質(zhì)量合格的首要指標，對檢驗人員的操作技能、專業(yè)判斷和業(yè)務素質(zhì)要求很高。家蠶微粒子病顯微鏡檢驗工作是一項繁瑣又極為嚴苛的工作過程，《桑蠶一代雜交種檢驗規(guī)程》NY/T 327-1997中分別對病蛾率和病卵率的抽樣比例與合格標準做出詳細規(guī)定[1-2]，因此，要求樣品制備人員有責任心，鏡檢人員具有豐富的理論知識和識別判斷微孢子的經(jīng)驗。農(nóng)村養(yǎng)蠶期分為春蠶、夏蠶和秋蠶，江蘇省蠶種繁育主要在春期。為了保障合格蠶種順利出庫，檢驗部門應及時接收母蛾樣品進行檢驗，做好檢驗過程的全面質(zhì)量管理，既要保障蠶種微粒子病方面的質(zhì)量安全，又要避免誤判造成經(jīng)濟損失。

1 強化過程管理，全面提高微粒子病檢驗水平

家蠶微粒子病檢驗應實施規(guī)范化管理，針對檢驗管理中的薄弱環(huán)節(jié)，完善管理措施，加強監(jiān)督制約，預防檢驗中可能出現(xiàn)的各類問題。

1.1樣品的接收與管理江蘇省采用委托檢驗的方式對家蠶母蛾和成品卵微粒子病進行檢疫。母蛾樣品接收時，應逐批核對生產(chǎn)單位、批次、品種名和送檢數(shù)量，檢查樣品外觀是否符合標準要求。一代雜交種成品卵樣品接收時，應核對樣品的基本信息，并檢查散卵盒外觀和特性。樣品清點檢查結束后雙方簽字確認。

1.2設備的管理家蠶微粒子病檢驗的主要儀器包括離心機、旋渦混合儀、顯微鏡等；母蛾樣品處理主要使用旋轉(zhuǎn)式烘蛾機和集團(群體)磨蛾機；成品卵樣品處理使用研缽和研棒。儀器設備由有資格的檢驗人員操作或使用，以確保檢驗過程安全、準確。儀器設備使用前后均應保證正常運行，一旦出現(xiàn)故障，應立即停止使用并做標識，在可能出現(xiàn)影響到檢驗結果的范圍內(nèi)對已檢樣品進行溯源。另外，非檢驗期間儀器設備應按要求校準或維護。

1.3檢驗環(huán)境的控制保持家蠶微粒子病檢驗實驗室環(huán)境的整潔是保證檢驗質(zhì)量的有效措施之一。根據(jù)檢驗標準和檢驗規(guī)程的規(guī)定，應配備相應的設施，并滿足使用條件的環(huán)境要求，力求儀器設備布局合理。檢驗員應熟悉環(huán)境條件，并檢查環(huán)境條件是否符合要求；設備員負責保證設施和環(huán)境條件滿足要求及日常的維持。當環(huán)境條件不符合要求時，應采取措施使之盡快滿足。

1.4鏡檢技術的提高1870年，法國巴斯德博士發(fā)現(xiàn)并利用家蠶微粒子病胚種傳染的特點，提出母蛾顯微鏡檢法，淘汰病蛾所產(chǎn)蠶卵，該方法十分經(jīng)典、有效、經(jīng)濟，并一直沿用到現(xiàn)在。隨著規(guī)模技術的改變，過去的單蛾全檢模式已發(fā)展為集團母蛾抽樣檢驗。鏡檢的準確性很大程度上取決于鏡檢人員的操作技能和專業(yè)判斷水準，而相關鏡檢設備條件的改善也使檢驗結果準確度提高。

1.5技術人員的管理不論是樣品編號、樣品保管、樣品處理，還是顯微鏡檢驗、消毒清洗，參與檢驗的技術人員均應經(jīng)崗位培訓，考核合格后上崗。為使技術人員的知識不斷更新，技能不斷熟練，素質(zhì)不斷提高，應定期組織開展技術培訓和知識更新的學習，注意對技術人員職業(yè)道德的教育，提高技術人員遵守規(guī)章制度和操作規(guī)程的意識。

1.6原始記錄的保存重視和規(guī)范原始記錄可為檢驗工作可追溯提供可靠的依據(jù)。因此，記錄應客觀、真實、準確和及時地反映檢驗過程和結果，以便在必要時可追溯，并保證檢驗在盡可能接近原條件的情況下可復現(xiàn)。

1.7檢驗前后信息的溝通家蠶微粒子病實驗室檢驗僅僅是微粒子病預防工作的一部分，為保證全面質(zhì)量管理，蠶種生產(chǎn)單位在送檢樣品時提供樣品的詳細信息，如生產(chǎn)單位、品種品系名稱、生產(chǎn)批次和送檢數(shù)量等；檢驗部門應在檢驗前對樣品信息進行重新編號處理，保證客戶送檢樣品信息安全，檢驗部門還應在全部檢驗流程中保證樣品序號傳遞和記錄無誤；檢驗報告應及時發(fā)送給各送檢單位，以便及時安排下一步處理。蠶種生產(chǎn)單位也要根據(jù)檢驗報告對帶毒母蛾所產(chǎn)蠶卵給予銷毀處理，相關部門進行監(jiān)管控制。

2 依靠質(zhì)量管理體系，有效提高微粒子病檢驗管理能力

質(zhì)量管理體系的建立和實施本身就是不斷提高檢驗管理水平的過程，為不斷尋找檢驗流程中的問題和不足，需要不斷對檢驗全過程實行糾正和改進，最終使質(zhì)量管理體系有效地運行和不斷地完善。建立健全質(zhì)量管理體系是家蠶微粒子病檢驗部門能夠公平、公正、準確、及時地提供檢驗結果的有力保障，不但有利于提高檢驗質(zhì)量和管理水平，也有利于蠶種生產(chǎn)單位和使用單位客觀、準確地對蠶種質(zhì)量做出評價。

2.1加強檢驗過程的監(jiān)督管理檢驗部門一般應設監(jiān)督員，專門負責對檢驗樣品、檢驗器具、檢驗方法、檢驗人員、檢驗過程、檢驗數(shù)據(jù)等進行監(jiān)督和控制。由于操作崗位之間聯(lián)系緊密，每道工序的檢驗人員都要對前道工序進行監(jiān)督檢查，檢驗人員之間也應在工作中互相監(jiān)督，確保樣品和操作過程準確無誤。管理人員還應根據(jù)檢驗進度進行不定期地監(jiān)督抽查。

2.2提高檢驗人員的質(zhì)量意識家蠶微粒子病檢驗質(zhì)量的好壞不但與檢驗設備、檢驗水平有關，更與檢驗人員的質(zhì)量意識相關。只有增強檢驗人員的質(zhì)量意識，才能提高檢驗人員工作的熱情和責任心。實施質(zhì)量責任分管制，對自己承擔的檢驗工作負責，同時努力提高技術能力。

2.3持續(xù)改進質(zhì)量管理體系開展家蠶微粒子病檢驗項目往往會出現(xiàn)不符合檢驗工作的情況，可能是偶發(fā)的對檢驗或檢驗結果沒有嚴重影響的不符合，也有可能對檢驗技術能力、檢驗結果的準確性和可靠性甚至檢驗管理體系產(chǎn)生嚴重不符合。這時應及時識別不符合，建立糾正預防措施，分析產(chǎn)生原因、潛在隱患、追溯可能產(chǎn)生不良影響的檢驗結果，對不符合項進行改正、評估，并啟動改進措施，對效果進行驗證、跟蹤，將嚴重程度和風險降到最低，確保檢驗質(zhì)量。如若出現(xiàn)嚴重后果，要及時與樣品送檢單位聯(lián)系溝通，做好處理和服務工作。

3 規(guī)范顯微鏡檢驗技術，保障微粒子病檢驗結果的準確性

顯微鏡檢驗技術是鑒別和檢驗微粒子病的有效技術，但很多因素可能影響微粒子病檢驗結果的準確性。因此，規(guī)范顯微鏡檢技術顯得尤為重要。

3.1規(guī)范的鏡檢技術因為鏡檢主要靠技術人員的肉眼在600倍視野中觀察微粒子孢子有無及數(shù)目，每個技術人員檢驗2個樣本，每個樣本不少于5個視野，并在檢驗結果有差異時進行復檢確認[2]，否則使用過程中人為因素和客觀條件很容易造成結果的誤判。

3.2顯微鏡的管理顯微鏡使用環(huán)境應保持干燥、整潔、平穩(wěn)，避免陽光直射，對目鏡、物鏡鏡片清潔時用酒精、乙醚混合液輕擦。檢驗期間顯微鏡應按儀器操作說明規(guī)范使用，并做好記錄，使用期限不超過校準有效期。顯微鏡應定期進行維護，每年送質(zhì)檢部門校準，并執(zhí)行期間核查程序，確保檢驗結果準確、有效。

3.3鏡檢人員的技術培訓從事家蠶微粒子病鏡檢工作的人員應每年接受專業(yè)技術培訓，包括顯微鏡的使用操作、家蠶微粒子孢子的相關知識、微粒子病檢驗的最新技術進展，以及蠶桑發(fā)展相關理論知識、質(zhì)量檢驗相關培訓等。定期對鏡檢技術進行培訓，有利于技術人員規(guī)范操作，提高鏡檢準確率和檢驗能力。

4 討論

4.1送檢樣品的真實性和代表性委托檢驗只對來樣負責，生產(chǎn)單位送檢的樣品務必與實際生產(chǎn)相符。另外家蠶一代雜交種微粒子病檢驗，不論是母蛾還是成品卵，都是抽樣檢驗，因此，抽樣一定要有代表性。

目前，江蘇省共有18家蠶種生產(chǎn)單位，商品蠶種的母蛾微粒子病檢驗由省級主管部門——江蘇省蠶種所統(tǒng)一負責，采用送樣委托檢驗的方式。因此，檢驗站的家蠶微粒子病檢驗任務繁重，責任重大。由于母蛾檢驗全部采用送樣方式，因此，很難解決母蛾抽樣中的非技術性問題，檢驗部門僅對送檢樣品負責[3]。《中華人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》對應承擔產(chǎn)品質(zhì)量責任的生產(chǎn)和銷售方做出了規(guī)定，質(zhì)量監(jiān)督工作由相應的監(jiān)督管理部門負責。因此，明確蠶種生產(chǎn)、檢驗和監(jiān)督各方的主體和責任，也是加強家蠶微粒子病檢驗和防控管理的趨勢。

4.2檢驗人員的技術水平與責任性基于顯微鏡技術的家蠶微粒子病檢驗，是一項技術要求高、任務重、壓力大的工作。為確保檢驗工作的質(zhì)量和進度，應對技術人員進行培訓，通過考核后持證上崗。同時，應定期組織開展技術培訓和知識更新的學習，使技術人員的知識不斷更新、技能不斷熟練、素質(zhì)不斷提高，應注意加強技術人員職業(yè)道德的教育，提高人員遵守規(guī)章制度和操作規(guī)程的意識。另外管理人員應加強對檢驗過程的監(jiān)督。

4.3檢驗技術的改進與提高顯微鏡鏡檢技術已有100多年歷史，且仍是目前家蠶微粒子病檢驗的主要方法。隨著生物科學的不斷進步，越來越多形式的免疫學或分子生物學檢驗方法用于檢驗家蠶微粒子病[4]。

4.3.1微孢子蟲染色鏡檢技術。由于顯微鏡肉眼觀察微孢子蟲對技術人員的熟練操作技巧和判斷能力要求較高，若技術不熟練很容易漏判或誤判微孢子，因此，科研人員針對微孢子蟲染色后用于鏡檢的技術進行一系列的研究。使用 KMnO4甲基紫法將家蠶微孢子蟲染成紫色，區(qū)別于其他家蠶病原孢子，提高檢出率[5]。使用熒光染色劑 Calcofluor White M2R 染色法染色后家蠶微孢子蟲孢子在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)青藍色熒光，光線穩(wěn)定，熒光強度高，特異性強，因此，檢驗高效、快速[6]。

4.3.2免疫學檢驗技術。根據(jù)抗原抗體特異性結合反應的原理，并有效結合免疫放大技術，近年來免疫學檢驗技術已逐步用于家蠶微孢子的鑒定。應用單克隆抗體技術，將抗家蠶微粒子孢子的單克隆抗體與免疫金銀染色法(IGSS)相結合，從光鏡水平對家蠶微孢子蟲進行鑒定[7]。應用炭素凝集反應法對家蠶母蛾微孢子進行檢驗，快速而且簡便[8]。應用酶標抗體間接法和酶標抗體PAP法對家蠶微孢子蟲孢子進

行鑒別診斷，前者相對簡單，后者敏感性更高[9]。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗和膠體金免疫層析試驗(GICA)組裝研制家蠶微孢子蟲快速檢驗試紙條，以期能夠靈敏、準確地診斷家蠶微粒子病[10]。

4.3.3分子生物學檢驗技術。分子生物學研究中PCR技術的應用最為常見，因該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡易、檢驗高效等特點，近年來也被用于家蠶微粒子病檢驗。多引物 PCR的方法能夠?qū)嶋H用于診斷早期的家蠶微孢子蟲[11]。通過優(yōu)化熒光定量PCR反應體系，已成功構建并研制出家蠶微孢子蟲診斷試劑盒[12]。PCR技術對樣品的要求較高，觀察時染色劑溴化乙錠(EtBr，EB)也對人體產(chǎn)生毒害作用?？蒲腥藛T利用原位雜交技術診斷家蠶卵及幼蟲體內(nèi)感染的家蠶微孢子蟲，但操作復雜，成本較高[13]。

21世紀初，日本科學家建立了環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，無需熱循環(huán)儀，能夠快速、簡單、高效的檢驗病原微生物。因此，科研人員將此方法應用在檢驗家蠶微粒子病上，玻璃珠破碎法、FTA卡和 LAMP 技術結合起來，建立一種快捷、高效、廣泛使用的家蠶微孢子蟲的檢驗方法[14]。但由于靈敏度較高，容易出現(xiàn)假陽性結果導致誤判，目前該技術還處于實驗室階段，尚未實現(xiàn)大規(guī)模用于生產(chǎn)中的家蠶微粒子病檢驗。

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