錢偉琨 段萬星 馬清涌

胰腺癌動(dòng)物學(xué)模型研究現(xiàn)狀

錢偉琨 段萬星 馬清涌

(馬清涌，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師。中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)胰腺癌專業(yè)委員會(huì)、CSCO胰腺癌專家委員會(huì)、中華醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)胰腺疾病分會(huì)委員、中國(guó)醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)腹部腫瘤專業(yè)委員會(huì)常務(wù)委員。中華胰腺病學(xué)雜志及多本專業(yè)雜志編委。主要研究方向胰腺疾病的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究。培養(yǎng)博士55名，已畢業(yè)42名。發(fā)表論文200余篇，包括SCI論文130余篇。獲陜西省科學(xué)技術(shù)二等獎(jiǎng)三項(xiàng)。)

現(xiàn)階段，胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)研究主要應(yīng)用的動(dòng)物模型可以分為移植瘤模型、基因工程鼠模型以及近年來興起的類器官模型[1]等。動(dòng)物模型具有動(dòng)物體型小、繁殖迅速、壽命長(zhǎng)(3年)等特點(diǎn)，可以更加真實(shí)地反映腫瘤在生物體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等情況，故對(duì)于PDAC發(fā)生的分子機(jī)制研究、抗腫瘤藥物篩選等具有重要的意義。

一、移植瘤模型

PDAC移植瘤模型有很多種，按移植部位可分為皮下移植瘤和胰腺原位移植瘤模型；按移植物來源可分為同種移植瘤和異種移植瘤模型，后者又按移植物種類分為基于人腫瘤細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞移植瘤模型和基于人腫瘤組織構(gòu)建的異種移植瘤(patient-derived tumour xenografts，PDXs)模型。PDAC移植瘤模型較體外細(xì)胞模型的優(yōu)勢(shì)在于能更加真實(shí)、系統(tǒng)地模擬腫瘤在生物活體內(nèi)生長(zhǎng)情況，反映生物體營(yíng)養(yǎng)、代謝、免疫狀況等對(duì)腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面的影響，較基因工程鼠模型造價(jià)低、操作簡(jiǎn)便、成瘤周期短。

細(xì)胞移植瘤模型是將人腫瘤細(xì)胞移植入免疫缺陷鼠皮下或胰腺原位，其缺陷在于移植物來源較為單一(常為一種腫瘤細(xì)胞)，代表性不足。PDAC是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞成分及來源多樣，間質(zhì)成分多樣，甚至在不同個(gè)體或同一個(gè)體不同時(shí)期呈現(xiàn)多樣性。全基因組測(cè)序證實(shí)，不同個(gè)體之間或同一個(gè)體的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶之間，PDAC具有很強(qiáng)的遺傳多樣性[2]。研究表明，豐富的基質(zhì)纖維化反應(yīng)是PDAC的一個(gè)顯著特征，PDAC腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞占比較少，其周圍包繞著大量的主要由胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSCs)產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)[2]和各種非腫瘤細(xì)胞例如間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管細(xì)胞等。為了更好地模擬出更真實(shí)的PDAC，本課題組將BxPC-3細(xì)胞和PSCs以5∶1比例混合制成單細(xì)胞懸液，注入Balb/c裸鼠皮下(100 μl)或胰腺原位(30 μl)成功構(gòu)建了PDAC間質(zhì)纖維化移植瘤模型[3]。

PDXs模型則是將新鮮的PDAC切除標(biāo)本碎片移植入免疫缺陷鼠皮下或胰腺原位，可以較細(xì)胞移植瘤模型更真實(shí)地反映出包括PDAC在內(nèi)的許多腫瘤的抗腫瘤藥物應(yīng)答反應(yīng)[4]。PDXs的缺陷在于構(gòu)建周期長(zhǎng)且對(duì)腫瘤組織的特性要求較高(如需要侵襲性高的腫瘤組織)，不適用于PDAC這種生存期短、手術(shù)機(jī)會(huì)較少的癌癥。此外，PDXs的腫瘤組織在連續(xù)傳代的過程中，其分子和組織學(xué)特性會(huì)發(fā)生改變[5]。

PDAC移植瘤模型的局限性還體現(xiàn)在皮下移植瘤模型是將腫瘤細(xì)胞或組織塊植入血供較為豐富、藥物灌注良好的受體皮下組織，故其不能模擬出真實(shí)的PDAC的乏血供、低藥物灌注狀態(tài)[6]，因此對(duì)PDAC轉(zhuǎn)移的研究?jī)r(jià)值相對(duì)較低[7]。此外，免疫系統(tǒng)與腫瘤的相互作用可影響PDAC的發(fā)生發(fā)展，如癌細(xì)胞可以表達(dá)PD-L1，并與CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte， CTL)表面的PD-1結(jié)合以抑制其遷移活化，從而減少CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別殺傷，與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)[8]；又如M2型巨噬細(xì)胞與胰腺癌的腫瘤免疫抑制和不良預(yù)后相關(guān)[9]等。為防止免疫排斥而使移植失敗，移植受體主要選用不同類型的免疫缺陷鼠，這就造成了PDAC移植瘤模型缺少了免疫系統(tǒng)與腫瘤之間的相互影響。這些局限性可能是造成以移植瘤模型為載體的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床試驗(yàn)結(jié)論不相符的原因所在。

二、基因工程鼠模型

由正常胰腺上皮演變?yōu)榘┙M織，至少需要發(fā)生4～5個(gè)基因突變事件[10]。胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中有4個(gè)主要的基因：K-ras、CDKN2A、Trp53和Smad4[11]。K-ras基因是PDAC最常見的突變基因之一，抑癌基因Trp53也影響PDAC的發(fā)生發(fā)展。LSL-KrasG12D；Pdx1-Cre(KC)、LSL-KrasG12D；LSL-Trp53R172H；Pdx1-Cre(KPC)[12-13]，即基于K-ras癌基因突變和(或)聯(lián)合Trp53抑癌基因突變所構(gòu)建的基因工程鼠模型是現(xiàn)階段研究較為常用的PDAC動(dòng)物模型，它可以很好地模仿PDAC的病理生理發(fā)展過程。構(gòu)建KC/KPC鼠是借助一種條件基因打靶技術(shù)——Cre-LoxP系統(tǒng)。先利用基因工程技術(shù)構(gòu)建一種表達(dá)載體(核心部件為被LoxP-Stop-LoxP序列錨定的目的基因，如LSL-KrasG12D、LSL-Trp53R172H)，其次將其導(dǎo)入預(yù)先獲得的鼠胚胎細(xì)胞，應(yīng)用同源重組技術(shù)將載體整合入胚胎細(xì)胞基因組中，并對(duì)其進(jìn)行篩選，然后將整合有目的基因的鼠胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入鼠胚胎使其發(fā)育成為成熟的嵌合體鼠，最后使之與野生型鼠雜交得到含目的基因的雜合子鼠。此外，還需應(yīng)用上述基因工程技術(shù)和雜交技術(shù)獲得帶胰腺特異性啟動(dòng)子-Cre酶(如Pdx1-Cre)的雜合子鼠，二者雜交形成最終的基因工程鼠模型。此模型的胰腺組織特異性表達(dá)Cre酶，識(shí)別切割LoxP-Stop-LoxP序列使目的基因得以表達(dá)。KC鼠可以很好地模擬胰腺正常腺泡→ADM→PanINs(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的變化，腫瘤進(jìn)展較為緩慢，其中位生存期在1年左右，因此它常用于腫瘤的發(fā)生、早期診斷和預(yù)防方面的研究。KPC鼠可以很好地模擬正常胰腺組織→PDAC甚至轉(zhuǎn)移癌的過程，腫瘤進(jìn)展相對(duì)迅速，其中位生存期在5個(gè)月左右，且其組織學(xué)形態(tài)表現(xiàn)為基質(zhì)成分豐富且乏血供[10]，對(duì)PDAC常規(guī)化療藥物吉西他濱具有耐藥性[14]，主要用于PDAC的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤免疫等方面的研究。KPPC鼠為抑癌基因Trp53純合子突變鼠，其腫瘤進(jìn)展迅速，腹水、黃疸、局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均較KPC模型嚴(yán)重且快速，中位生存期僅2個(gè)月左右[15]。

其他PDAC基因工程鼠模型如Garcia-Carracedo等[16]通過構(gòu)建MT-TGFα、Smad4f/f；p48-Cre (S4)、Smad4f/f；MT-TGFα、p48-Cre (STP)3種模型，顯示Smad4缺失和TGF-α高表達(dá)可促進(jìn)PDAC的轉(zhuǎn)移、PanINs的發(fā)展以及纖維化過程。Gruber等[17]通過構(gòu)建R26-LSL-YFP、LSL-KrasG12D、±Yapf/f、±Tazf/f、±Stat3f/f、Ela1-CreERT2模型，表明PDAC的主要細(xì)胞學(xué)來源是胰腺腺泡細(xì)胞，而非導(dǎo)管細(xì)胞或泡心細(xì)胞，提出了腫瘤的命名方式應(yīng)該由其來源確定而非后期形態(tài)來確定的理念。總之，基因工程鼠模型的優(yōu)勢(shì)決定了其在PDAC研究中的核心地位，但局限性在于設(shè)計(jì)難度大、操作復(fù)雜、構(gòu)建困難、造價(jià)昂貴，故其廣泛應(yīng)用仍受到一定程度的限制。

三、類器官模型

Boj等[1]在前人研究的基礎(chǔ)上開發(fā)出PDAC類器官模型。首先取小葉內(nèi)導(dǎo)管細(xì)胞(來自野生型小鼠正常胰腺組織和KC鼠PanINs-1a/b胰腺組織)包埋入人工基底膜進(jìn)行3D培養(yǎng)，然后將其原位移植入小鼠胰腺。結(jié)果野生型小鼠構(gòu)建的模型表現(xiàn)為正常胰腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，KC鼠構(gòu)建出PDAC類器官模型。應(yīng)用人正常胰腺和人PDAC，也獲得了人源性腫瘤組織構(gòu)建的PDAC類器官模型。

PDAC類器官模型的優(yōu)勢(shì)在于該模型能夠高度模仿人PDAC完整的病理生理發(fā)展過程(包括各種級(jí)別的PanINs、侵襲性PDAC以及轉(zhuǎn)移瘤)，還可以觀察到類似于人和基因工程鼠模型中的PDAC的膠原沉積[1,6]。應(yīng)用類器官模型可以在體內(nèi)研究人PanINs的結(jié)構(gòu)、早期標(biāo)志物，從而進(jìn)一步研究PDAC早期診斷與治療技術(shù)。

四、結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用PDAC動(dòng)物模型可以更加真實(shí)地反映人PDAC的病理生理發(fā)展過程和分子機(jī)制，對(duì)揭示促進(jìn)PDAC快速進(jìn)展的因素、探索非手術(shù)治療方案、改善胰腺癌預(yù)后具有重要意義。從移植瘤模型到基因工程鼠模型再到類器官模型，每種模型都有其自身的優(yōu)勢(shì)和局限，要求我們?cè)谶M(jìn)行PDAC的研究時(shí)，一方面要選擇恰當(dāng)?shù)哪Ｐ瓦M(jìn)行合適的研究得出合理的結(jié)論，揚(yáng)長(zhǎng)避短，最大限度地減小實(shí)驗(yàn)誤差和偏倚，另一方面要不斷完善PDAC模型，為PDAC的基礎(chǔ)研究創(chuàng)造最符合真實(shí)情況的工具。只有這樣，才能更加清楚、準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)PDAC，為PDAC的醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究提供理論基礎(chǔ)。

[1] Boj SF, Hwang CI, Baker LA, et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer[J]. Cell, 2015,160(1-2):324-338. DOI: 10.1016/j.cell.2014.12.021.

[2] Jones S, Zhang X, Parsons DW, et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses[J]. Science, 2008,321(5897):1801-1806. DOI: 10.1126/science.1164368.

[3] Duan W, Chen K, Jiang Z, et al. Desmoplasia suppression by metformin-mediated AMPK activation inhibits pancreatic cancer progression[J]. Cancer Lett, 2017,385:225-233. DOI: 10.1016/j.canlet.2016.10.019.

[4] Garber K. From human to mouse and back: ‘tumorgraft’ models surge in popularity[J]. J Natl Cancer Inst, 2009,101(1):6-8. DOI: 10.1093/jnci/djn481.

[5] Aparicio S, Hidalgo M, Kung AL. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models[J]. Nat Rev Cancer, 2015,15(5):311-316. DOI: 10.1038/nrc3944.

[6] Olive KP, Jacobetz MA, Davidson CJ, et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer[J]. Science, 2009,324(5933):1457-1461. DOI: 10.1126/science.1171362.

[7] Pothula SP, Xu Z, Goldstein D, et al. Key role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2016,381(1):194-200. DOI: 10.1016/j.canlet.2015.10.035.

[8] Nomi T, Sho M, Akahori T, et al. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res, 2007,13(7):2151-2157. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-06-2746.

[9] Witkiewicz A, Williams TK, Cozzitorto J, et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma recruits regulatory T cells to avoid immune detection[J]. J Am Coll Surg, 2008,206(5):849-854. DOI: 10.1016/j.jamcollsurg.2007.12.014.

[10] Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis[J]. Cell, 1990,61(5):759-767.

[11] Kamisawa T, Wood LD, Itoi T, et al. Pancreatic cancer[J]. Lancet, 2016,388(10039):73-85. DOI: 10.1016/S0140-6736(16)00141-0.

[12] Hingorani SR, Petricoin EF, Maitra A, et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse[J]. Cancer Cell, 2003,4(6):437-450.

[13] Hingorani SR, Wang L, Multani AS, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice[J]. Cancer Cell, 2005,7(5):469-483. DOI: 10.1016/j.ccr.2005.04.023.

[14] Jacobetz MA, Chan DS, Neesse A, et al. Hyaluronan impairs vascular function and drug delivery in a mouse model of pancreatic cancer[J]. Gut, 2013,62(1):112-120. DOI: 10.1136/gutjnl-2012-302529.

[15] Morton JP, Timpson P, Karim SA, et al. Mutant p53 drives metastasis and overcomes growth arrest/senescence in pancreatic cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(1):246-251. DOI: 10.1073/pnas.0908428107.

[16] Garcia-Carracedo D, Yu CC, Akhavan N, et al. Smad4 loss synergizes with TGFα overexpression in promoting pancreatic metaplasia, PanIN development, and fibrosis[J].PLoS One,2015,10(3):e0120851. DOI: 10.1371/journal.pone.0120851.

[17] Gruber R, Panayiotou R, Nye E, et al. YAP1 and TAZ control pancreatic cancer initiation in mice by direct up-regulation of JAK-STAT3 signaling[J]. Gastroenterology, 2016,151(3):526-539. DOI: 10.1053/j.gastro.2016.05.006.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(81672434、81472248)

710061 西安，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

馬清涌，Email: qyma56@xjtu.edu.cn

2017-01-25)

呂芳萍)