郭孝玉，張瀟月，李奇勇1， ，張麗華1， ，劉冬玲1，，林曉娟 ，王穩(wěn)健,張 嚴(yán)1，

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 三明365004；2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004)

粉防己堿對(duì)銅綠微囊藻的化感作用

郭孝玉1,2，張瀟月2，李奇勇1，2，張麗華1，2，劉冬玲1，2，林曉娟2，王穩(wěn)健2,張 嚴(yán)1，2

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 三明365004；2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004)

篩選高效化感物質(zhì)是生物防治水華現(xiàn)象研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，為了探析防己提取的粉防己堿對(duì)銅綠微囊藻的化感作用，采用控制對(duì)比實(shí)驗(yàn)，設(shè)置對(duì)照和0.1、0.2、0.3和0.4 mg/L 4種粉防己堿濃度，觀測(cè)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。研究表明：粉防己堿顯著抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)，粉防己堿水溶液濃度越大抑藻作用越明顯，最高抑制率達(dá)97%，0.40 mg/L為最佳抑藻濃度。粉防己堿為抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)提供新的依據(jù)，為治理銅綠微囊藻爆發(fā)生長(zhǎng)，提供高效環(huán)保材料和措施的新思路。

銅綠微囊藻；粉防己堿；防己；藍(lán)藻水華；半效濃度

當(dāng)前,水體富營(yíng)養(yǎng)化已經(jīng)成為全球性的環(huán)境問(wèn)題,大量N、P、K等養(yǎng)分通過(guò)各種途徑進(jìn)入水體，引起水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻類爆發(fā)性生長(zhǎng)[1]。藍(lán)藻水華不僅會(huì)造成水生生物的大量死亡，還產(chǎn)生藻毒素和臭味污染水源，影響飲用水安全[2-3]。銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是藍(lán)藻水華最常見的藻種，具有很強(qiáng)的光合作用能力。國(guó)內(nèi)外針對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化引起藍(lán)藻爆發(fā)防治的方法主要分為物理法、化學(xué)法和生物法[4-6]。眾多學(xué)者研究認(rèn)為通過(guò)生物化感作用防治藍(lán)藻水華現(xiàn)象，是一種高效且安全的抑藻方法,許多學(xué)者研究了水生或旱生植物的浸提取物對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制效果，取得顯著成效，如蘆竹、蘆葦、菖蒲、荇菜、鳳眼蓮和睡蓮提取物挺水植物[7-9]，菹草、光葉眼子菜和金魚藻、黑藻、穗花狐尾藻等沉水植物[10-11]，也有石蒜科植物如洋蔥、大蔥及鮮韭菜等農(nóng)作物[12]，甚至用茱萸、香加皮、蒼耳子、五倍子、防己等中藥材的提取物[13-16]，這些植物組織器官均對(duì)特定藻類表現(xiàn)出明顯的化感抑制作用。

防己（Stephania tetrandra）為多年生藤本，廣泛分布浙江、福建、江西等地，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒和抗高血壓等效用[17]。柴民偉等（2010）研究了12種具有消炎抑菌作用中藥用植物干品對(duì)蛋白核小球藻的抑制效果，發(fā)現(xiàn)防己水浸提物在相對(duì)濃度為1 g/L時(shí)，抑藻效應(yīng)最佳[16]。防己對(duì)治理水華爆發(fā)有較好的應(yīng)用前景,但防己浸提物中的化感活性物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞的作用機(jī)理仍不十分明確，尚未見報(bào)道。本研究分析粉防己堿對(duì)銅綠微囊藻化感效應(yīng)，為闡明粉防己堿的化感作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藻種為藍(lán)藻門的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)，該藻種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢淡水藻種庫(kù)，將無(wú)菌環(huán)境中配置的BG-11培養(yǎng)基置于50 mL錐形瓶中無(wú)菌培養(yǎng)，光暗比為12 h∶12 h人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，白天溫度為25±1℃，夜晚溫度為18±1℃，每天手工輕輕搖動(dòng)2～4次，光照強(qiáng)度為2000 lx、濕度為95%[1,8,14]。觀察其長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期再轉(zhuǎn)接一次，鏡檢無(wú)雜藻且生長(zhǎng)良好，作為試驗(yàn)藻種。供試的抑藻物質(zhì)為防己提取的粉防己堿，純度大于98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 粉防己堿溶液配制

粉防己堿水溶液的配制：用電子天平（CP-214）稱量得0.9 mg粉防己堿試劑，溶解于25 mL無(wú)菌容量瓶，加蒸餾水至刻度，震蕩搖勻，放入溫度設(shè)置為25℃，頻率調(diào)為100%的超聲清洗器中處理2 h使其溶于水，配制成粉防己堿水溶液相對(duì)濃度為36.0 mg/L母液。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）高溫高壓對(duì)BG-11溶液培養(yǎng)基滅菌：將BG-11溶液每20 mL移于50 mL錐形瓶中，用面塞塞住，用報(bào)紙和棉線將每個(gè)小瓶包扎好，放入高壓滅菌鍋滅菌，溫度設(shè)為121℃，進(jìn)行高溫高壓滅菌。

（2）銅綠微囊藻的接種：在超凈臺(tái)中，將所有的培養(yǎng)基和藻種、移液槍、燒杯、酒精燈等需要的物品用酒精消毒后，在酒精燈旁用移液槍分別向培養(yǎng)銅綠微囊藻的小錐形瓶中加入20 μL原處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻，藻細(xì)胞初始密度均為5.0×105cells/mL。

（3）接入粉防己堿溶液：用移液槍分別向培養(yǎng)銅綠微囊藻的小錐形瓶中加入不同體積的粉防己堿水溶液的母液，使粉防己堿的濃度分別為0.1、0.2、0.3和0.4 mg/L 4種各3個(gè)平行樣，同時(shí)對(duì)照（CK）實(shí)驗(yàn)樣中加入等量的蒸餾水，共設(shè)置5組，將其全部放入人工氣候培養(yǎng)箱中，按設(shè)置條件開始試驗(yàn)每隔24 h用血球計(jì)數(shù)板在雙目顯微鏡下對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)藻，記錄觀測(cè)時(shí)間日期和藻密度，連續(xù)追蹤7 d。如此設(shè)置做4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將銅綠微囊藻細(xì)胞計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換為藻類密度（N/mL），采用單因素方差分析粉防己堿對(duì)銅綠微囊藻的影響，采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。藻類生長(zhǎng)抑制率(IR)計(jì)算公式:IR(%)=(1－N/N0)×100%，其中N為處理組藻類密度，N0為同期對(duì)照組的藻類密度。通過(guò)Logit概率模型求出各濃度化感物質(zhì)的半效濃度EC50,確定最佳防治銅綠微囊藻生長(zhǎng)的劑量。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS2 0.0軟件處理與分析。

2 結(jié)論與討論

2.1 粉防己堿水溶液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

粉防己堿4種濃度與對(duì)照組（CK）分別連續(xù)觀測(cè)7 d，銅綠微囊藻生長(zhǎng)變化情況見圖1：對(duì)照組（CK）和0.1 mg/L濃度的粉防己堿，藻類生長(zhǎng)規(guī)律均為先緩慢增長(zhǎng)到指數(shù)增長(zhǎng)，第7天對(duì)照組的藻密度達(dá) 1.86×107cells/mL,0.1mg/L 的藻密度為 1.13×107cells/ml；但濃度為 0.2、0.3、0.4 mg/L 粉防己堿溶液對(duì)銅綠微囊藻呈現(xiàn)明顯的抑制作用，第4天后均呈下降趨勢(shì)，藻密度均低于1.9×106cells/mL，第7天藻密度在0.4～1.3×106cells/ml。從圖1（B）生長(zhǎng)抑制率來(lái)看，濃度為0.2、0.3和0.4 mg/L處理的銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制率在第4天達(dá)43%～53%，第5天達(dá)73%～87%，第6天達(dá)88%以上，而0.1 mg/L處理的藻類的生長(zhǎng)抑制率在第4天后維持在35%左右，見表1。方差齊性檢驗(yàn)表明第1天至第3天表現(xiàn)為方差齊性(p＞0.248)，各組間差異不顯著；而ANOVA方差分析表明防己濃度越大藻類生長(zhǎng)抑制效果越明顯，第4天不同處理組間差異顯著（p＜0.05），第5天后不同組間達(dá)極顯著差異（p＜0.01）。不同時(shí)期銅綠微囊藻生長(zhǎng)的SNK多重方差比較分析表明：前3天不同組間無(wú)顯著差異（p＞0.05），而第4天開始對(duì)照組CK與粉防己堿處理組有顯著差異，第5天開始0.1 mg/L處理組與0.2、0.3、0.4 mg/L組間有明顯差異（p＜0.05），,粉防己堿濃度越高抑藻效果越明顯，但SNK檢驗(yàn)表明0.2、0.3和0.4 mg/L 組間無(wú)顯著差異（p＞0.11）。

圖1 粉防己堿濃度對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

2.2 抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的半抑制粉防己堿濃度

采用Logit模型擬合銅綠微囊藻響應(yīng)粉防己堿濃度的效應(yīng)（見表2），模型的Chi-Square卡方檢驗(yàn)值為1.525（p＜0.01），得到概率為0.5時(shí)半抑制濃度（EC50）值為0.40，與分析表明該抑藻實(shí)驗(yàn)中粉防己堿濃度為0.40 mg/L的效果最佳。

表2 Logit模型參數(shù)估計(jì)a

2.3 分析與討論

粉防己堿是一種有效抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)的化感物質(zhì)。已有研究用高效液相色譜分析法驗(yàn)證了防己浸提液中抑藻主要化學(xué)成分含有防己若林堿和粉防己堿，且它們均屬于芐基異喹啉類生物堿，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、看菌等多方面藥理作用[17-19]。銅綠微囊藻屬于藍(lán)藻門又和細(xì)菌有微妙相似點(diǎn)，由于藍(lán)藻門藻的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)中無(wú)核膜核仁，細(xì)胞壁與細(xì)菌相似，屬原核生物，進(jìn)行有絲分裂繁殖，由肽聚糖組成，革蘭染色呈陰性。Mo S,et al.(2010)報(bào)道了生物堿Hapalindole對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制作用[20]，其抗炎殺菌的作用機(jī)理同樣也可能適用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)類似細(xì)菌的銅綠微囊藻。王彩萍等（2006）研究顯示微量加熱法中粉防己堿對(duì)大腸桿菌有很好的抑制效果[21]，本研究也證實(shí)粉防己堿水溶液對(duì)銅綠微囊藻具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用（見表1），其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)防己浸提液對(duì)綠藻門中蛋白核小球藻有抑制作用的[16]。本實(shí)驗(yàn)第3天才觀察到有細(xì)胞破裂，粉防己堿類生物堿對(duì)銅綠微囊藻滲透作用過(guò)程比較緩慢，說(shuō)明化感物質(zhì)對(duì)細(xì)胞器膜滲透性的影響，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和亞顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量滲出，影響酶的活性降低了光合效率而導(dǎo)致細(xì)胞衰退。本研究模擬得到最佳半效應(yīng)濃度(EC50)值為0.40 mg/L，這與其他學(xué)者研究結(jié)果一致，均在統(tǒng)一數(shù)量級(jí)，如李鋒民等（2007）研究從大型挺水植物蘆葦中分離鑒定出化感物質(zhì)2-甲基乙酰乙酸乙酯，對(duì)銅綠微囊藻化感抑制作用的半效應(yīng)濃度(EC50)值為0.65 mg/L[22]。防己是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，為綜合利用中藥材達(dá)到“以廢治廢”，在防藍(lán)藻爆發(fā)時(shí)通過(guò)計(jì)算水體量獲得最有效濃度，在富營(yíng)養(yǎng)水體里投放適宜量的粉防己堿母液，或在湖邊栽種防己植物，利用防己分泌產(chǎn)生的生物堿等，通過(guò)生物化感作用從而防治藍(lán)藻水華現(xiàn)象是一種有益的防治措施。

4 結(jié)論

粉防己堿水溶液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，濃度越高抑制效果越好，當(dāng)濃度為0.4 mg/L時(shí)，第6天后銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制率達(dá)94%；抑制銅綠微囊藻的最佳濃度為0.40 mg/L。

[1]潘琦， 鄒國(guó)燕，宋祥甫，等．美人蕉根系對(duì)銅綠微囊藻的化感作用[J]．環(huán)境科學(xué)研究，2014，27（10）：1193－1198．

[2]李艷紅．環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和光合作用的影響[D]．南昌：南昌大學(xué)，2010．

[3]張青田，王新華，林超，等．不同氮源對(duì)銅綠微囊藻增殖的影響[J]．水生態(tài)學(xué)雜志，2011，32（4）：115－120 ．

[4]葉良濤，錢家忠，左勝鵬，等．氮磷對(duì)銅綠微囊藻化感抗性的誘導(dǎo)效應(yīng)[J]．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011（6）：122－128．

[5]錢方．不同氮、磷濃度條件下銅綠微囊藻差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D]．廈門：廈門大學(xué)，2006．

[6]張青田，王新華，林超，等．水體 pH 和銅綠微囊藻增殖的關(guān)系研究[J]．水生態(tài)學(xué)雜志，2011，32（2）：52－56．

[7]陳建中， 李利芳，張海洋，等．蘆竹和睡蓮對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)[J]．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34（7）：35－37．

[8]巨穎琳，李小明．南四湖 3 種沉水植物對(duì)銅綠微囊藻化感作用研究[J]．山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2011，46（3）：1－8．

[9]莊源益，趙凡，戴樹桂，金朝輝．高等水生植物對(duì)藻類生長(zhǎng)的克制效應(yīng)[J]．環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1995，12（3）：44－50．

[10]李江， 祝志林， 劉少博．荸薺對(duì)銅綠微囊藻的化感抑制作用研究[J]．中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2015，35（5）：1474－1479．

[11]汪麗，王國(guó)祥，唐曉燕，等．荇菜（Nymphoides peltatum）對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)及其機(jī)制[J]．生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，26（3）：257－263．

[12]周揚(yáng)，李源，李誠(chéng)，等．大蔥抑藻效應(yīng)及其化感物質(zhì)分類鑒定[J]．衛(wèi)生研究，2013，42（6）：987－994．

[13]劉文桃．韭菜提取物對(duì)銅綠微囊藻化感抑制的研究[D]．揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2009．

[14]孔江紅，謝欽銘，劉襄河，等．蟛蜞菊對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制作用研究[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（4）：712－716．

[15]王壽兵，許博，楊天翔，等．九種中藥植物提取物對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響[J]．復(fù)旦學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011（5）：667－669．

[16]柴民偉，石福臣，馬妍．防己抑藻效應(yīng)及其化感物質(zhì)的 HPLC 分析[J]．植物研究，2010，30（ 6）：758－762．

[17]熊一力，王宏偉，姚偉星．粉防己堿對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠管平滑肌細(xì)胞增殖及對(duì)PDGF－B，bFGF和相關(guān)癌基因表達(dá)的影響[J]．中國(guó)誤診學(xué)雜志，2002，2（1）：62－63．

[18]ZHANG SHU LIN，ZHANG B，DAI WEI，et al．Oxidative damage and antioxidant responses inMicrocystis aeruginosaexposed tothe allelochemical berberine isolated from golden thread[J]．Journal of Plant Physiology，2011（168）：639–643．

[19]TOMIOKA N IMAI A，KOMATSU K．Effect of light availability onMicrocystis aeruginosablooms in shallow hypereutrophic Lake Kasumigaura[J]．Journal of Plankton Research，2011，33（8）：1263－1273．

[20]MO S，KRUNIC A，SANTARSIERO B D，et al．Hapalindole－related alkaloids from the cultured cyanobacteriumFischerella ambigua[J]．Phytochemistry，2010，71（17）：2116－2123．

[21]王彩萍，盧海峰，張洪林，等．微量量熱法研究大腸桿菌對(duì)粉防己堿和粉防己總生物堿的耐藥性[J]．應(yīng)用化學(xué)，2006，23（8）：942－944．

[22]李鋒民，胡洪營(yíng),種云霄,等．蘆葦化感物質(zhì)對(duì)藻類細(xì)胞膜選擇透性的影響[J]．環(huán)境科學(xué)，2007，28(11):2453-2456.

Growth and Allelopathic Effects of Microcystis Aeruginosa under Different Concentration Tetrandrine

GUO Xiao-yu1,2,ZHANG Xiao-yue2,LI Qi-yong1,2,ZHANG Li-hua1,2,LIU Dong-ling1,2,LIN Xiao-juan2,WANG Wen-jian2,ZHANG Yan1,2
(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring&Sustainable Management and Utilization,Sanming 365004,China；2.College of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Biology allelopathy is an efficient and safe biological control method to prevent Cyanobacterial bloomt.In order to verify the allelopathy of tetrandrine onMicrocystis aeruginosa,we used control experiments,designed control(CK)and four tetrandrine concentration(0.1 mg/L,0.2mg/L,0.3mg/L,0.4mg/L),for cultivatingMicrocystis aeruginosaand observating consecutive seven days.The results showed that tetrandrine inhibited the growth ofMicrocystis aeruginosa.The greater the concentration,the more obvious the inhibitory effect on algae,and the inhibition rate reached up 97%.When the concentration of tetrandrine was 0.40 mg/L,it was the best concentration of suppression of Microcystis aeruginosa.The results provide a new basis for exploring the effective way to restrain Cyanobacteria growth,and provide an environmental measures to treatment ofMicrocystis aeruginosa.

Microcystis aeruginosa;tetrandrine;the root of Menispermaceae;Cyanobacterial bloom;50%effect concentration

X171.5

A

1673-4343（2017）06-0057-05

10．14098/j．cn35－1288/z．2017．06．009

2017-06-05

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014J01136）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（科研A類）（JA14288）；三明學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（ZL0917/CS）

郭孝玉，男，福建尤溪人，博士。主要研究方向：資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)。通訊作者：張嚴(yán)，男，廣東平遠(yuǎn)人，副教授。主要研究方向：有害藻類的植物化感抑制技術(shù)。

朱聯(lián)九）