石慶會，張桂清，韋中學，吳 楠，張 嚴

（1.三明學院 資源與化工學院，福建 三明365004；2.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經營利用重點實驗室，福建 三明 365004；3.福建省礦山生態(tài)修復工程技術研究中心，福建 三明 365004）

基于線粒體多基因串聯(lián)序列的蜆蝶類系統(tǒng)發(fā)生關系分析

石慶會1,2,3，張桂清1，韋中學1，吳 楠1，張 嚴1,2,3

（1.三明學院 資源與化工學院，福建 三明365004；2.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經營利用重點實驗室，福建 三明 365004；3.福建省礦山生態(tài)修復工程技術研究中心，福建 三明 365004）

測定了蜆蝶類兩個代表種（波蜆蝶、銀紋尾蜆蝶）的線粒體基因 16S rRNA、Cytb、COI、COIII的部分序列。同時，結合GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的其他蝶類 52個代表種相應的基因序列，選取蛾類 2個代表種作為外類群?；谶@4個基因的串聯(lián)序列，分別使用鄰接法、最大簡約法、最大似然法和貝葉斯推論法重新構建了蝶類的分子系統(tǒng)樹，分析了蜆蝶類的系統(tǒng)發(fā)生關系。序列分析結果顯示：經比對處理后串聯(lián)序列共有 4784個同源位點，其中保守位點2113個，變異位點2669個，簡約信息位點2149個；A+T平均含量為 76.8%，具有明顯的AT偏倚性。分子系統(tǒng)樹表明：蜆蝶類形成一個單系群，并與灰蝶科形成姊妹群，結果進一步表明蜆蝶類與灰蝶科具有較近的親緣關系，但能否歸入灰蝶科還有待于進一步的論證。

鱗翅目；蜆蝶科；線粒體基因；系統(tǒng)發(fā)生關系

蜆蝶類隸屬于鱗翅目、鳳蝶總科，是小型或中型美麗的蝴蝶。有的性二型很明顯，無季節(jié)差異。幼蟲寬扁，一般多毛，與灰蝶相似。取食某些藥用植物，如千里光及薊類植物。蜆蝶善于模擬其他蝶類的形態(tài)，而且顏色和翅形多種多樣，故不易辨認。全世界已知1500多種，中國有 26種，90%以上的種類分布在新熱帶區(qū)，而古北區(qū)、東洋區(qū)和非洲區(qū)種類較少。目前，有關蜆蝶系統(tǒng)發(fā)生地位的界定還存在一定的分歧。形態(tài)學上，由于蜆蝶類與灰蝶類具有相似的形態(tài)特征和生活習性，具有相同的寄主植物，部分學者認為兩者具有較近的親緣關系，并將蜆蝶類視為灰蝶科中的一個亞科[1-3]。然而，其他的形態(tài)學研究結果卻認為蜆蝶類應作為一個獨立的科級分類階元[4]。近二十多年來，隨著 DNA測序與序列分析和分子系統(tǒng)學研究技術的日益成熟，關于蜆蝶類系統(tǒng)發(fā)生地位及其與其他蝶類系統(tǒng)發(fā)生關系的分子系統(tǒng)學研究也取得了一定的進展。但是，相關研究結果之間還存在較大的爭議。主要存在兩種觀點，一種觀點認為蜆蝶應作為一個獨立的科級分類階元，并與灰蝶科形成姊妹群[5-9]。另一種觀點卻支持將蜆蝶科歸入灰蝶科[10-11]。由此可見，關于蜆蝶類的系統(tǒng)發(fā)生地位的界定還需要更多分子標記和分析方法的介入，并結合形態(tài)學、分子生物學及其他相關學科證據(jù)進行綜合分析。

線粒體DNA由于具有分子量小、結構簡單、母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組并且進化速度快等特點而被廣泛的應用于動物系統(tǒng)發(fā)育與進化、群體遺傳學以及比較和功能基因組的研究[12-13]。因此，本文擬通過 PCR擴增技術補充測定蜆蝶類 2個代表種，即波蜆蝶（Zemeros flegyas）（波蜆蝶屬）和銀紋尾蜆蝶 （Dodona eugenes）（尾蜆蝶屬）的線粒體基因 16S rRNA、Cytb、COI、COIII的部分序列。同時，結合已知的其他蝶類主要類群代表種的相應基因序列數(shù)據(jù)，選擇適宜的蛾類代表種作為外類群，運用多種建樹方法重建蝶類主要類群的分子系統(tǒng)樹，進一步探討蜆蝶類的系統(tǒng)學地位，從而為蜆蝶類乃至整個蝶類的系統(tǒng)學和分類學研究提供更多新的分子生物學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本的采集和保存

實驗所用的波蜆蝶和銀紋尾蜆蝶標本分別采集于江西九連山 （2014年 8月）和四川青城山（2015年5月）。標本采集后參考《中國蝶類志》[14]進行鑒定與登記，再浸泡于無水乙醇中，帶回實驗室后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取與純化

利用動物基因組 DNA快速抽取盒 （生工生物工程 （上海）股份有限公司，型號：B518221-0050）提取基因組 DNA，具體的操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3 PCR擴增與測序

實驗擴增的4種短基因片段（16S rRNA、Cytb、COI、COIII）均采用通用引物進行擴增。擴增反應體系共 50 μL， 其中包括 Buffer （含 Mg2+） 溶液 8 μL、 BSA 溶液 8 μL、 dNTP 溶液 1.2 μL、DNA1.5～2.5 μL、 正向引物 1 μL、 反向引物 1 μL、Taq酶 0.8 μL 以及滅菌水 ddH2O 若干 （將體系補充至 50 μL）。

擴增反應程序為：95℃預變性 5 min；95℃變性 1 min；退火 （溫度根據(jù)引物的不同而變化)）1 min；72℃延伸 1 min 30 s，循環(huán)次數(shù)為 35次；最后 72℃總延伸 10 min。 PCR擴增產物利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化測序。

1.4 數(shù)據(jù)的收集與整理

本文從 GenBank數(shù)據(jù)庫中共下載了其他蝶類 52個代表種和外類群2個代表種雕尺蛾（Biston panterinaria）、桑彌尺蛾 （Phthonandria atrilineata）的線粒體基因組全序列，并從中截取4個基因（16S rRNA、 Cytb、 COI、 COIII） 的相應序列進行相關分析（表 1）。

表1 分析類群代表種的序列來源信息

續(xù)表1

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1 序列組成與變異分析

將所測定的序列在NCBI網站上運用BLAST功能進行序列比對，確認所測序列為目的基因序列，并確保序列方向一致。運用MEGA 6.0軟件[15]進行序列對位排列、序列組成與進化特征分析。

1.5.2 堿基替代飽和度分析

分子數(shù)據(jù)通常要進行多重替代（multiple substitution）或出現(xiàn)飽和（saturation）現(xiàn)象，受進化噪音影響的可能性較大，從而對系統(tǒng)發(fā)育分析產生一定的影響，尤其是距離法或最大簡約法分析。因此，對數(shù)據(jù)進行堿基替代飽和度分析是必要的。本文運用MEGA 6.0[15]軟件分別統(tǒng)計數(shù)據(jù)集中各序列之間的差異度（轉換Ts、顛換Tv）和相應的遺傳距離（p-distance），并以差異度為縱軸，遺傳距離為橫軸在Excel中作散點圖，判斷其是否達到飽和。隨著距離的增加，觀察到的差異數(shù)不再增加時，則認為此序列達到飽和，重建系統(tǒng)發(fā)生時要進行特別加權[16]。

1.5.3 遺傳距離的計算

遺傳距離能夠更全面地反映親本品種間的遺傳差異，是衡量品種間若干性狀綜合遺傳差異大小的指標。本文運用MEGA 6.0軟件15]，將對比過的數(shù)據(jù)先按照不同類群進行分組，再基于p-distance模型計算組間平均遺傳距離。

1.6 分子系統(tǒng)樹的構建

分別采用鄰接法（neighbor joining，NJ）、最大簡約法（maximum parsimony method，MP）、最大似然法（maximum likelihood method，ML）和貝葉斯推論法（Bayesian inference，BI），重新構建蝶類主要類群54個代表種的分子系統(tǒng)樹。NJ樹通過MEGA 6.0軟件[15]構建，具體參數(shù)設置如下：Method：p-distance，Variance Estimation Method：Bootstrap method，No.of Bootstrap Replications：1000，Substitutions to Include：d:Transitions+Transversions，系統(tǒng)發(fā)生樹采用內部分支檢驗和1000次抽樣自展檢驗來評估各節(jié)點的置信度。MP樹和ML樹分別通過PAUP*4.0b10軟件和RaxML在線構建，均采用啟發(fā)式搜索，系統(tǒng)樹各分支的置信度分別以1000次自舉檢驗值和100次自舉檢驗值表示。應用Modeltest 3.7軟件在 AIC標準下估算出構建 MP樹和ML樹時所用的最優(yōu)模型 （GTR+I+Γ）。BI樹利用 MrBayes 3.1.2（Huelsenbeck and Ronquist,2001）構建，所用的模型與構建MP樹和ML樹時所用到的模型相同，即 lset設置替換模型 nst=6（GTR模型），位點速率變異模型設置為rates=gamma（gamma分布）。同時建立4條馬爾科夫鏈（MCMC chains），以隨機樹為起始樹，共運行25萬代，每100代抽樣一次，重復1次，直至標準誤差小于0.01，每2 500代抽樣一次，舍棄老化樣本構建一致樹。

2 結果

2.1 序列組成與變異

本文分析的54個蝶類代表種的16S rRNA、Cytb、COI和COIII基因序列，經比對剪切后，長度分別為1 372、1 126、1 505和781 bp，4個基因的串聯(lián)序列總長度為4 784 bp。串聯(lián)序列中保守位點2 113個，變異位點為2 669個，簡約信息位點為2 149個（表2）。

基因序列堿基組成分析結果顯示，不論是單個基因還是串聯(lián)基因序列，A+T平均含量均超過了70%，并明顯高于G+C的平均含量，與其他鱗翅目昆蟲線粒體基因一樣，具有明顯的AT偏倚性（表 3）。

表2 4個基因序列及其串聯(lián)序列的進化特征

表3 4個基因及其串聯(lián)序列堿基組成

2.2 堿基替換

本研究運用MEGA 6.0軟件[15]分別統(tǒng)計了串聯(lián)序列之間的差異度（轉換Ts、顛換Tv）和相應的遺傳距離（p-distance），并以差異度為縱軸，遺傳距離為橫軸在Excel中作散點圖如圖1所示。結果顯示：隨著遺傳距離的增加，轉換與顛換均出現(xiàn)遞增的趨勢，并保持著良好的線性關系，轉換與顛換值均未超過2.0表明堿基替換代未出現(xiàn)飽和狀態(tài)。因此，串聯(lián)基因序列轉換與顛換的信息都將應用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)生樹的構建。

2.3 遺傳距離分析

采用 MEGA6.0軟件[15]基于K2P模型計算6科54種蝶類與外類群之間的遺傳距離，結果如表4所示。結果顯示：蝶類各科間的遺傳距離介于0.118～0.163之間，平均遺傳距離為0.134，其中蜆蝶類與灰蝶科的遺傳距離最?。?.118），而蜆蝶類與蛺蝶科的遺傳距離為0.129。由此可見，本文所選取的蜆蝶類與灰蝶科間的親緣關系相對于蛺蝶科更為親近。

圖1 本研究串聯(lián)基因序列的堿基替代飽和度散點圖

表4 基于串聯(lián)基因序列計算蝶類主要類群間的平均遺傳距離

2.4 系統(tǒng)發(fā)生關系分析

基于4個基因的串聯(lián)序列，以蛾類的兩個代表種作為外類群，分別應用鄰接法、最大簡約法、最大似然法和貝葉斯推論法重建了蝶類的分子系統(tǒng)樹。結果顯示，NJ樹、MP樹、ML樹以及BI樹的拓撲結構基本一致，其中ML樹和BI樹最為穩(wěn)定，如圖3～4所示。

ML樹和BI樹均顯示，蛺蝶科、灰蝶科、蜆蝶科、粉蝶科、弄蝶科、鳳蝶科的代表種均形成單系群，其中蜆蝶形成一個獨立支系（ML樹和BI樹的置信值分別為64%和0.94），并與灰蝶科形成穩(wěn)定的姊妹群（ML樹和BI樹的置信值分別為100%和1.00）。然而，蛺蝶科并沒有直接與灰蝶科形成姊妹群，而是與灰蝶科+蜆蝶科的組合群形成姊妹群 （ML樹和BI樹的置信值分別為80%和1.00），蝶類主要類群間的系統(tǒng)發(fā)生關系可表示為（（（（蛺蝶科+（灰蝶科+蜆蝶科））+粉蝶科）+弄蝶科）+鳳蝶科）。

3 討論

通過對蝶類6科54個代表種4個線粒體基因（16S rRNA、COI、COIII、Cytb）部分序列及其串聯(lián)基因序列進行分析，結果顯示，4個線粒體基因出現(xiàn)明顯的A+T含量偏高的現(xiàn)象，這與其他文獻報道的昆蟲線粒體基因核苷酸組成頻率相一致，均存在富含AT堿基現(xiàn)象[17]。Knight and Mindell（1993）認為轉換顛換比的值小于2.0，則此基因序列的突變已達到飽和狀態(tài)，受進化噪音影響的可能性較大，重建系統(tǒng)發(fā)生時不進行特別加權就會得出錯誤信息[18]。根據(jù)已有的研究認為，出現(xiàn)這種結果的原因有兩個：第一，可能是由于某些位點發(fā)生了多次轉換替代，即轉換出現(xiàn)了飽和現(xiàn)象；第二，與高A+T含量有很大的關系，由于高A+T含量增加了顛換的可能性[19]。本文序列分析結果顯示，無論是單個基因序列還是串聯(lián)序列，均出現(xiàn)富含A+T堿基的現(xiàn)象，究其原因，本文認為是由于高A+T含量導致顛換增加的可能性。本文分子系統(tǒng)樹分析結果顯示，蜆蝶類的代表種形成單系群，并與灰蝶科具有較近的親緣關系。同時，組間遺傳距離分析結果顯示，蜆蝶類與灰蝶科的遺傳距離最小，同樣表明兩者之間具有較近的親緣關系，這與前期基于分子證據(jù)的部分研究結果相吻合[5-9]。然而，本文所選取的蜆蝶類代表種存在一定的局限性，未能涵蓋蜆蝶所有的分類群，因此并不能直接認定蜆蝶類可以作為灰蝶科內的一個亞科級分類階元，并不支持前期基于形態(tài)學證據(jù)[1-3]和部分分子證據(jù)[10-11]的研究結果。

圖2 基于串聯(lián)基因序列構建的蝶類主要類群的ML樹

圖3 基于串聯(lián)基因序列構建的蝶類主要類群的BI樹

綜上所述，本文認為蜆蝶類還是作為一個科級分類階元--蜆蝶科較為合理，并與灰蝶科具有較近的親緣關系。至于能否將其作為一個亞科級分類階元歸入灰蝶科，還有待于更多蜆蝶代表種以及更多分子證據(jù)的的介入進行更充分的論證。

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Phylogenetic Placement of Riodinids(Lepidoptera:Papilionidae)Based on Multiple Mitochondrial Gene Sequences

SHI Qing-hui1,2,3,ZHANG Gui-qing1,WEI Zhong-xue1,WU Nan1,ZHANG Yan1,2,3
(1.School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring and Sustainable Management and Utilization,Sanming University,Sanming 365004,China;3.Fujian Province Engineering Research Center of Mine Ecological Construction,Sanming University,Sanming 365004,China)

The partial mitochondrial 16S rRNA,Cytb,COI and COIII genes ofZemeros flegyasandDodona eugeneswere newly amplified and sequenced.Meanwhile,the homologous sequences of 52 representative species of butterfly were obtained from the GenBank.Based on these data,the sequence variation and the phylogenetic relationship of these groups were analyzed,and the phylogenetic trees of the 54 species from all currently recognized families of butterfly were reconstructed based the combined dataset of the four gene sequences with the neighbor joining (NJ),maximum parsimony(MP),maximum likelihood (ML)and Bayesian Inference(BI)methods.The results of the sequence analysis showed that the four combined genes are 4784 bp in length by alignment,including 2113 conserved sites,2669 variable sites and 2149 parsimonious-informative sites,and the average percentage of A+T is 76.8%.The results of phylogenetic analyses indicated that the riodinid butterflies were strongly supported monophyletic groups and sister to Lycaenidae.Therefore,the results of this paper further confirmed that the Riodinidae and Lycaenidae are more closely to each other.However,it is needed to further prove whether it belongs to Lycaenidae.

lepidoptera;riodinidae;mitochondrial gene;phylogeny

Q969.432.1

A

1673-4343（2017）06-0009-09

10．14098/j．cn35－1288/z．2017．06．002

2017-09-29

福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JAT160456）；三明學院科學研究基金（B201605）；福建省科技廳自然科學基金項目（2017J05059）；福建省自然科學基金項目（2014J01136）

石慶會，男，安徽宿松人，講師，博士。主要研究方向：昆蟲資源監(jiān)測、分子系統(tǒng)學與進化生態(tài)學。

朱聯(lián)九）