張 敏， 于成功,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科

普拉梭菌及其上清液對葡聚糖酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠Treg/Th17平衡的影響

張 敏1， 于成功1,2

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科

目的探討普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii，F(xiàn).prausnitzii)及其上清液對葡聚糖酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠Treg/Th17平衡的影響。方法將40只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常組、結(jié)腸炎對照組、F.prausnitzii活菌干預(yù)組、F.prausnitzii上清干預(yù)組，每組10只，正常組正常飲水，其余各組均飲用質(zhì)量濃度為25 g/L的葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型，同時分別用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、F.prausnitzii、F.prausnitzii上清灌胃。流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟中的Treg、Th17比例，并計算各組Treg/Th17比值；ELISA法檢測外周血清中IL-10、IL-17水平；RT-PCR檢測結(jié)腸組織中Foxp3、ROR-γt mRNA的表達。結(jié)果與結(jié)腸炎對照組相比，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組的Treg細胞比例上升，Th17細胞比例下降，Treg/Th17比值升高；且血清中IL-10水平升高，IL-17水平降低(P<0.05)。與結(jié)腸炎對照組相比，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組Foxp3 mRNA表達上升(P<0.05)，但F.prausnitzii活菌干預(yù)組Foxp3 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩干預(yù)組腸組織中ROR-γt mRNA表達較結(jié)腸炎對照組下降(P<0.05)。結(jié)論F.prausnitzii及其上清液可調(diào)控T細胞亞群，其機制可能為通過提高Foxp3 mRNA表達，抑制ROR-γt mRNA的表達調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡。

普拉梭菌；結(jié)腸炎；Treg細胞；Th17細胞

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)為腸道慢性非特異性及復(fù)發(fā)性炎癥，包含潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。目前認為，腸道菌群參與下引起腸黏膜免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，進而導(dǎo)致腸組織損傷、炎癥進展為其研究熱點[1-2]。Treg細胞能夠減輕炎癥反應(yīng)，抑制自身免疫反應(yīng)，而Th17細胞可促進炎癥反應(yīng)，參與自身免疫反應(yīng)。普拉梭菌(F.prausnitzii)作為腸道益生菌一種，對維護腸道菌群的穩(wěn)態(tài)起重要作用，可分泌丁酸鹽及未知產(chǎn)物。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).prausnitzii具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。本實驗通過建立IBD模型，經(jīng)F.prausnitzii及其上清干預(yù)后，觀察脾臟中T淋巴細胞亞群的變化及Treg/Th17細胞的比例，探討F.prausnitzii對實驗性結(jié)腸炎的免疫調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1動物C57BL/6J小鼠(美國Jackson Laboratory)共40只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量21～23 g。飼養(yǎng)于南京鼓樓醫(yī)院無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物實驗中心，造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2試劑DSS(MP Biomedicals)；F.prausnitziiATCC27766(美國模式菌種保藏中心)，血晶質(zhì)、纖維二糖、L-半胱氨酸(SIGMA)、腦心浸液(B&D)、酵母提取物(OXOID)、麥芽糖(AMRESCO)； FITC標記抗鼠 CD4 抗體、APC標記抗鼠 CD25 抗體、PE標記抗鼠Foxp3抗體(eBioscience，Inc)，破膜固定套裝(eBioscience)，紅細胞裂解液(MILTENYI BIOTEC)，APC標記抗鼠 CD3抗體、PE標記抗鼠IL-17抗體(eBioscience，Inc.)，淋巴細胞刺激劑leukocyte activation cocktail with BD GolgiPlug(BD Biosciences)，固定/破膜試劑盒(BD Biosciences)；反轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒及TRIZOL裂解液(TAKARA)；小鼠IL-17、IL-10 ELISA試劑盒(eBioscience，Inc)。

1.3方法

1.3.1F.prausnitzii培養(yǎng)及上清液制備：把F.prausnitzii接種在37 ℃厭氧箱中LYHBHI培養(yǎng)基，培育48 h，OD值計菌數(shù)達1×109CFU/ml。同時將新鮮菌液5 000 r/min離心5 min，取F.prausnitzii上清液凍干成粉，100 ml上清約可得到 3 g 凍干粉，將凍干粉按1∶5的比例以 PBS 稀釋，4 ℃冰箱備用。

1.3.2 動物模型制備、分組、標本處理：40只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常組、結(jié)腸炎對照組、F.prausnitzii活菌干預(yù)組，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組，每組10只，正常組正常飲水，其余各組均飲用質(zhì)量濃度為25 g/L的葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型,干預(yù)組小鼠分別用0.2 ml/10 gF.prausnitzii及等量的F.prausnitzii上清液每天灌胃1次，結(jié)腸炎對照組以等量的PBS每天灌胃1次，連續(xù)7 d。第8天用頸椎脫臼法處死小鼠，眼眶取血，無菌取脾及結(jié)腸。

1.3.3 流式檢測脾臟中Treg、Th17細胞比例：無菌取小鼠新鮮脾結(jié)，充分研磨后，加入紅細胞裂解液3 ml，靜置5 min,PBS洗滌2次。予PBS重懸后計數(shù)，取細胞1×106加表面抗體APC-CD25 0.8 μl，F(xiàn)ITC-CD4 1.0 μl，振蕩，避光20 min，1 ml PBS洗滌1次，蝸旋，速度在4～5次為宜，加入固定破膜劑800 μl,避光1～2 h，用破膜Buffer洗滌2次，加入PE-Foxp3 2.5 μl，4 ℃避光孵育45 min，1×Buffer洗滌1次，用PBS重懸至100 μl后上機檢測。

予PBS重懸后計數(shù)，取細胞1×106，加入淋巴細胞刺激劑2 μl/ml，放入37 ℃體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，加1 ml PBS，300×g, 5 min離心，棄上清后加入表面抗體APC-CD3 1 μl、FITC-CD4 1 μl，4 ℃避光孵育40 min，1 ml PBS，300×g，5 min離心棄上清后輕度渦旋，使細胞完全重懸，加入250 μl固定/破膜劑，4 ℃避光孵育20 min后，加入1 ml破膜Buffer，250×g離心5 min，棄上清后再重復(fù)清洗1次，加入胞內(nèi)抗體PE-IL-17 1 μl、4 ℃避光孵育1 h，加入1 ml破膜Buffer，250×g離心5 min離心,棄上清，以150～300 μl PBS重懸后上機檢測。

1.3.4 ELISA法檢測外周血清中IL-10、IL-17水平：按照試劑盒說明進行操作。

1.3.5 RT-PCR檢測結(jié)腸組織中Foxp3、ROR-γt mRNA的表達：在各組中隨機抽取4只小鼠，提取結(jié)腸中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用其為模板行RT-PCR擴增。Foxp3引物F：5′-TCCCAGAGTTCTTCCACAAG-3′；R： 5′-TAAGGGTGGCATAGGTGAAA-3′；ROR-rt引物F：5′-CACGGCCCTGGTTCTCAT-3′；R： 5′-GCAGATGTTCCACTCTCCTCTTCT-3′；內(nèi)參GAPDH引物F：5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′；R： 5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，重復(fù)40個循環(huán)。結(jié)果用2-△△Ct計算Foxp3、ROR-γt mRNA的表達量。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠脾單核細胞中Treg細胞、Th17細胞比例及Treg/Th17細胞比例與結(jié)腸炎對照組相比，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組的Treg細胞比例上升，Th17細胞比例下降，Treg/Th17比值升高(P<0.05)(見表1)。

2.2血清中IL-10、IL-17的含量F.prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組血清中IL-10水平較結(jié)腸炎對照組升高，IL-17水平較結(jié)腸炎對照組降低(P<0.05)(見圖1)。

表1 各組脾臟中Treg細胞和Th17細胞比例及Treg/Th17比率Tab 1 Proportion of Treg cells and Th17 cells in spleen and the ratio of Treg/Th17 in each group (±s)

注：與結(jié)腸炎對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：與結(jié)腸炎對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3結(jié)腸組織中Foxp3、ROR-γtmRNA的表達與結(jié)腸炎對照組相比，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組的Foxp3 mRNA的表達上升(P<0.05)，但F.prausnitzii活菌干預(yù)組Foxp3 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩干預(yù)組腸組織中ROR-γt mRNA的表達較結(jié)腸炎對照組的表達下降(P<0.05)(見圖2)。

注：與結(jié)腸炎對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

F.prausnitzii屬于厚壁菌門，作為腸道益生菌的一種，對維護腸道菌群的穩(wěn)態(tài)起重要作用，可分泌丁酸鹽及未知產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).prausnitzii具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[3]。本課題組前期的動物實驗[4]發(fā)現(xiàn)，對于TNBS誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎大鼠，F(xiàn).prausnitzii及上清通過增加脾臟中Treg細胞比例發(fā)揮治療作用，具體機理不清。也有研究[5]發(fā)現(xiàn)，對于DSS誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎小鼠，F(xiàn).prausnitzii上清可通過抑制脾和腸道Th17細胞的生成，減少促炎因子IL-17A的釋放，從而減輕腸道炎癥,說明益生菌在IBD治療方面具有舉足輕重的地位。Treg細胞可降低炎性反應(yīng)，抑制炎性進展，在維持免疫穩(wěn)態(tài)及抗炎等過程中扮演重要角色。研究[6]證明，Treg細胞數(shù)量減少或功能下降與IBD的發(fā)展相關(guān)。動物實驗研究[7]顯示，通過體內(nèi)輸注Treg細胞，重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠的結(jié)腸炎癥狀可以減輕。臨床研究[8]表明，與正常人相比，IBD患者外周血Treg細胞比例顯著下降。Th17細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群以分泌IL-17為特征的CD4+T 細胞亞群，該細胞及其相關(guān)炎癥因子對IBD的發(fā)病有重要作用，大量研究[9-11]已證實，Th17細胞亞群可引起嚴重免疫反應(yīng)性疾病。因此，通過提高Treg細胞比例，降低Th17細胞比例，調(diào)控兩者之間的平衡，用以治療IBD為目前關(guān)注的熱點。由于Th17細胞在淋巴結(jié)中含量較低(1%～2%)，提取難度大，且缺乏特異性表面標記，其特異性標記為細胞內(nèi)分泌的IL-17細胞因子，難以通過流式方法獲得腸道相關(guān)淋巴組織中的Th17細胞，一定程度上限制了其研究的可行性。故本實驗只做了脾的流式，某種程度也能說明問題。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與結(jié)腸炎對照組相比，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組的Treg細胞比例上升，Th17細胞比例下降，Treg/Th17比值升高。提示F.prausnitzii及其上清可調(diào)控T細胞亞群 Treg/Th17的平衡來控制結(jié)腸炎炎癥。Treg細胞以分泌TGF-β和IL-10在IBD中發(fā)揮抗炎作用。IL-10主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生，具有抗炎作用。研究[12]證明，IL-10缺失可導(dǎo)致與CD相似的結(jié)腸炎，且CD的復(fù)發(fā)與低含量IL-10相關(guān)。動物實驗?zāi)Ｐ捅砻?，IL-10基因敲除的小鼠可制備出與人類相似的結(jié)腸炎模型，而對于TNBS模型的結(jié)腸炎大鼠，給予IL-10治療后，可緩解結(jié)腸炎的癥狀[13]。由此可知，抗炎因子IL-10對IBD防治有重要影響。Th17細胞分泌的細胞因子IL-17、IL-6和IL-22有明顯的致炎作用，能促進免疫反應(yīng)的發(fā)生[14]。其中IL-17A的致炎性最為顯著，通過增加細胞的通透性及促進其他炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生方式，發(fā)揮致炎作用[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和F.prausnitzii上清干預(yù)組血清中IL-10水平較結(jié)腸炎對照組升高，IL-17水平較結(jié)腸炎對照組降低。提示F.prausnitzii活菌及其上清通過上調(diào)抗炎因子IL-10的表達，下調(diào)炎癥因子IL-17的表達，抑制其他炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生，進而減輕全身炎癥反應(yīng)。

Foxp3是Foxhead家族成員，表達于CD4+CD25+Treg細胞上，是Treg細胞特異轉(zhuǎn)錄因子。Foxp3不僅數(shù)量上更多地表達于CD4+CD25+Treg細胞，同時對其生物學(xué)特性有重要作用，尤其表現(xiàn)在對Treg細胞的發(fā)育和功能方面[16-17]，而機體Treg細胞發(fā)育異?？芍麦w內(nèi)免疫功能紊亂，進而與IBD的發(fā)生相關(guān)。研究[16-18]表明，F(xiàn)oxp3基因突變可導(dǎo)致Treg細胞的數(shù)量明顯減少或功能明顯降低，引起人和小鼠發(fā)生較重的自身免疫性疾病。為進一步說明F.prausnitzii及其上清對Treg細胞的影響。本實驗還檢測小鼠結(jié)腸組織中Foxp3 mRNA的相對表達水平。結(jié)果顯示，與結(jié)腸炎對照組相比，F(xiàn).prausnitzii上清干預(yù)組的Foxp3 mRNA的表達上升，但F.prausnitzii活菌干預(yù)組Foxp3 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但有上升趨勢。本實驗說明，F(xiàn).prausnitzii上清的抗炎作用是通過促進Foxp3 mRNA的表達，進而增加CD4+CD25+Treg細胞，發(fā)揮抑制免疫效應(yīng)，F(xiàn).prausnitzii上清的效果優(yōu)于活菌組，具體作用機制不明。Th17細胞分化依賴于信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3，并需要關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子維A酸相關(guān)核孤兒受體ROR-γt的表達[19]。因此本實驗還檢測小鼠結(jié)腸組織中ROR-γt mRNA的相對表達水平，進一步說明F.prausnitzii及其上清對Th17細胞的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn).prausnitzii活菌干預(yù)組和其上清干預(yù)組腸組織中ROR-γt mRNA的表達較對照組表達下降。提示F.prausnitzii及其上清可通過下調(diào)結(jié)腸黏膜組織Th17細胞的表達，減少炎癥因子的釋放，從而減輕結(jié)腸炎癥。

綜上所述，F(xiàn).prausnitzii及其上清可調(diào)控T細胞亞群，通過提高腸道中Foxp3 mRNA的表達，抑制ROR-γt mRNA的表達，促進脾臟Treg細胞的生成，減少Th17細胞，調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡，從而減輕腸道炎癥及全身炎癥反應(yīng)。本研究為臨床F.prausnitzii及其上清治療IBD提供了一種新的思路。但F.prausnitzii上清中包含哪些具體物質(zhì)？這些物質(zhì)對免疫調(diào)節(jié)所起的具體作用機制及其對Foxp3、ROR-γt基因的平衡調(diào)控蛋白水平上的研究是未來需要進一步研究的方向。

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EffectofFaecalibacteriumprausnitziianditssupernatantonthebalanceofTreg/Th17indextransulfatesodium-inducedcolitismice

ZHANG Min1, YU Chenggong1,2

1.Department of Gastroenterology, Drum Tower School of Clinical Medicine, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210008; 2.Department of Gastroenterology, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, China

ObjectiveTo investigate the effect of Faecalibacterium prausnitzii (F.prausnitzii) and its supernatant on the balance of Treg/Th17 in mice induced by dextran sulfate sodium.MethodsA total of 40 C57BL/6J mice were randomly divided into four groups: normal group, colitis model group,F.prausnitziitreatment group andF.prausnitziisupernatant treatment group, respectively. The normal group drunk water normally, colitis were induced by drinking 25 g/L DSS solution in the other groups, which were injected the PBS, theF.prausnitziiand theF.prausnitziisupernatant through the stomach, respectively. Percentages of Treg cells and Th17 cells in spleen were analyzed by flow cytometry, and the ratio of Treg/Th17 was calculated. Serum levels of IL-10 and IL-17 were measured by ELISA and the levels of Foxp3 and ROR-γt mRNA in colonic tissue were detected by RT-PCR.ResultsPercentage of Treg cells inF.prausnitziitreatment group andF.prausnitziisupernatant treatment group in spleen was higher than that in colitis model group, and the percentage of Th17 cells in the two treatment groups in spleen was lower than that in colitis model group. The ratio of Ttreg/Th17 in the two treatment groups was higher than that in the colitis model group. Serum level of IL-10 inF.prausnitziitreatment group and theF.prausnitziisupernatant treatment group was higher than that in colitis model group, and serum level of IL-17 in the two treatment groups was lower than that in colitis model group. Compared with the colitis model group, the expression of Foxp3 mRNA inF.prausnitziisupernatant treatment group in colonic tissues was increased, but the expression of Foxp3 mRNA had no difference inF.prausnitziitreatment group. The expression of ROR-γt mRNA in the two treatment groups in colonic tissues were lower than that in colitis model group.Conclusion

TheF.prausnitziiand its supernatant could regulate the T lymphocyte subsets by increasing the expression of Foxp3 mRNA and inhibiting the expression of ROR-γt mRNA, which might regulate the balance of Treg/Th17.

Faecalibacterium prausnitzii; Colitis; Treg cell; Th17 cell

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.12.018

國家自然科學(xué)基金項目(81470819)

張敏，碩士研究生，研究方向：炎癥性腸病。E-mail:3054720471@qq.com

于成功,博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：炎癥性腸病、消化道腫瘤等。E-mail: chenggong_yu@nju.edu.cn

R574

A

1006-5709(2017)12-1396-05

2017-02-26

馬 軍)