張永民，張靜，宋利春 編譯

(1.江南大學(xué)；2神華億利能源有限責(zé)任公司電廠)

酶催化酸性油連續(xù)法制備脂肪酸乙酯

張永民1，張靜2，宋利春2編譯

(1.江南大學(xué)；2神華億利能源有限責(zé)任公司電廠)

采用從嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）中提取的Lipozyme TL IM（Novozymes，Seoul, Korea）作為固定化脂肪酶，考察了其催化酸性油與乙醇反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的合成工藝。其中原料酸性油主要是由米糠油精制過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物（皂腳）的酸化獲得。研究了水含量、反應(yīng)溫度和物料比對(duì)該工藝的影響，并對(duì)固定化脂肪酶重復(fù)利用過(guò)程中Lipozyme TL IM的相對(duì)活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明：反應(yīng)物中水含量對(duì)酯的收率影響很大，最佳含水量為4%；最佳反應(yīng)溫度是20℃，酸性油/乙醇的最佳物料比為1:4。在最佳工藝條件下，最大收率為92%，產(chǎn)物組成為92%脂肪酸乙酯、3%脂肪酸和5%酰基甘油。通過(guò)間歇性的乙醇洗滌工藝可將反應(yīng)生成的甘油去除，并且脂肪酶在循環(huán)使用了27次后依然可以保持82%以上的相對(duì)活性。以平均4 h滯留時(shí)間計(jì)算，Lipozyme TL IM在不進(jìn)行乙醇洗滌和進(jìn)行乙醇洗滌兩種工藝中的半衰期分別為39和45次循環(huán)。

酸性油；生物柴油；連續(xù)反應(yīng)釜；脂肪酸乙酯；嗜熱菌脂肪酶；酯交換

隨著人們對(duì)傳統(tǒng)石油基燃料帶來(lái)的一系列環(huán)境問題的擔(dān)憂，生物柴油作為化石燃料的替代品，日益引起人們的廣泛關(guān)注。生物柴油不僅是可重復(fù)利用的、生物降解的和相對(duì)無(wú)毒的，而且排放物中含有的懸浮顆粒和溫室氣體（如CO、CO2、SOx）也很低。同時(shí)，生物柴油具有良好的潤(rùn)滑性能，可以顯著提高發(fā)動(dòng)機(jī)效率，延長(zhǎng)使用壽命。此外，生物柴油不會(huì)產(chǎn)生易燃易爆氣體，閃點(diǎn)高。因此，相對(duì)于傳統(tǒng)柴油，生物柴油的運(yùn)輸、使用和儲(chǔ)存更加安全。

生物柴油主要由脂肪酸單烷酯組成。這些脂肪酸可以來(lái)自于植物油，也可以來(lái)自于動(dòng)物脂肪。通過(guò)簡(jiǎn)單的脂肪酸與短鏈醇間的酯交換反應(yīng)即可制得生物柴油。

酯交換反應(yīng)既可通過(guò)化學(xué)催化實(shí)現(xiàn)，也可通過(guò)酶催化實(shí)現(xiàn)。雖然利用化學(xué)催化劑（氫氧化鈉或氫氧化鉀）已經(jīng)成功制備了生物柴油，但是該工藝卻有無(wú)法回避的缺點(diǎn)：副產(chǎn)物甘油難回收和反應(yīng)結(jié)束后必須去除催化劑。相比之下，酶法制生物柴油可以很好地避免這些問題。更為重要的是以脂肪酶作為催化劑，反應(yīng)條件可以更加溫和，允許水的存在，避免皂的生成，進(jìn)而提高反應(yīng)產(chǎn)率。

皂腳是油類精煉過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，產(chǎn)生于工藝中的中和階段。對(duì)皂腳簡(jiǎn)單酸化處理，即可得到酸性油。由于米糠油中脂肪酶的高水解活性，使得在米糠油的精煉過(guò)程中產(chǎn)生了大量皂腳。因此，米糠皂腳被認(rèn)為是生物柴油工業(yè)的一種理想的低價(jià)原料來(lái)源。

基于填充床反應(yīng)器（PBR）的連續(xù)操作工藝是一種最適合酶催化脂肪酸反應(yīng)的工業(yè)技術(shù)。該工藝的最大優(yōu)勢(shì)就是反應(yīng)可以在非常短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡。其次，該工藝非常適宜規(guī)?；糯笊a(chǎn)，可以有效地將反應(yīng)產(chǎn)物與固定化催化劑分離，并且固定化酶的穩(wěn)定性已經(jīng)得到極大改進(jìn)，也為該工藝的連續(xù)循環(huán)操作貼上了低成本的標(biāo)簽。

到目前為止，Novozym 435、Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM等商品化固定化脂肪酶已在填充床反應(yīng)器中被應(yīng)用于各種酶催化反應(yīng)。其中，提取自嗜熱菌的商品酶Lipozyme TL IM是最廉價(jià)的固定化酶之一，它被廣泛應(yīng)用于生物柴油工業(yè)生產(chǎn)。

本文研究了Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇在填充床反應(yīng)器中的酯交換反應(yīng)。分別考察了初始水含量、反應(yīng)溫度和物料比對(duì)酶催化酯交換工藝的影響，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析確立最佳工藝參數(shù)。在最佳工藝條件下，考察了Lipozyme TL IM的相對(duì)活性和甘油對(duì)Lipozyme TL IM相對(duì)活性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

米糠油皂腳（CJ LTE.，Seoul, Korea），固定化嗜熱菌脂肪酶（Lipozyme TL IM，Novozymes，Korea），酶的活性為180,875 U/mg，其他試劑均為分析純。

1.2 酸性油的制備

在配有RZR 2051葉輪混合器（Heidolph,Schwabach, Germany）的3000 mL三口燒瓶?jī)?nèi)，依次添加100 g米糠油皂腳，300 mL異丙醇，300 mL正己烷和100 mL去離子水。室溫?cái)嚢?，邊攪拌邊滴?0 wt%硫酸，直至反應(yīng)體系的pH降至2～3左右。繼續(xù)攪拌1 h后反應(yīng)結(jié)束，靜置。溶液分為上下兩層，用分液漏斗將含有鹽水、異丙醇和其它水溶性物質(zhì)的下層放出，將含有酸性油和正己烷的上層用熱水反復(fù)洗滌，直至水相pH為中性時(shí)結(jié)束。油相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后通過(guò)減壓蒸餾去除溶劑。所得酸性油組成（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為：（53.7 ±1.3）%脂肪酸，（2.4 ± 0.1）%單甘酯，（9.1 ±1.2）%雙甘酯，（28.8 ± 0.5）%三甘酯和（6.0 ±0.6）%其他物質(zhì)。酸性油中的脂肪酸主要為棕櫚酸（21.6%），硬脂酸（1.6%），油酸（38.8%），亞油酸（36.5%）和亞麻酸（1.5%）。100 g皂腳大約可獲得54 g酸性油。

1.3 Lipozyme TL IM催化酯交換反應(yīng)

Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇間的酯交換反應(yīng)在如圖1a 所示的小型填充床反應(yīng)器中進(jìn)行。該反應(yīng)器由長(zhǎng)5.1 cm的不銹鋼管（0.48 cm I.D.）構(gòu)成。反應(yīng)物為乙醇和由米糠油皂腳制得的酸性油。固定化Lipozyme TL IM堆積在填充床反應(yīng)器中。由注射泵(Model 200; KD Scientific, New Hope, Pa., U.S.A.)將反應(yīng)物連續(xù)不斷地從50 mL 玻璃注射器內(nèi)輸送到反應(yīng)器中。整個(gè)反應(yīng)器浸沒在水浴中，并用循環(huán)水和溫度控制器（Lauda, Lauda-K?nigshofen, Germany）保持溫度的恒定。反應(yīng)物從底部進(jìn)入反應(yīng)器，隨著液面上升將空氣驅(qū)趕出去。每次實(shí)驗(yàn)前都應(yīng)對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行預(yù)處理以確保熱平衡和空氣被驅(qū)趕干凈，然后收集樣品。

為了獲得最佳的工藝條件，分別研究了水含量、反應(yīng)溫度和脂肪酸與乙醇物料比在0～6 %，0～40 ℃和1:3～1:6范圍變化時(shí)酯交換反應(yīng)的結(jié)果。

圖1 Lipozyme TL IM 催化酯交換反應(yīng)使用的填充床反應(yīng)器（PBR）工藝圖

1.4 酶的重復(fù)利用

以循環(huán)次數(shù)作為指標(biāo)對(duì)經(jīng)過(guò)不同程度使用后酶的相對(duì)活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，進(jìn)而探究了連續(xù)操作工藝下殘留的甘油對(duì)Lipozyme TL IM催化酯交換反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)裝置如圖1b所示。實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下進(jìn)行，即4%含水量，20℃，脂肪酸與乙醇物料比為1:4，反應(yīng)物在反應(yīng)器內(nèi)滯留時(shí)間為4h。采用兩種不同的填充床工藝對(duì)比研究了副產(chǎn)物甘油對(duì)酶的抑制作用。第一種工藝對(duì)反應(yīng)器中的甘油不作任何處理，作為控制對(duì)照工藝；第二種工藝?yán)酶倪M(jìn)的裝置增加洗滌步驟，即利用乙醇間歇性地清洗反應(yīng)器和Lipozyme TL IM固體顆粒，從而將包埋的或吸附的甘油從反應(yīng)器中去除。對(duì)于實(shí)驗(yàn)12、24、36和48，分別用10 mL乙醇來(lái)去除甘油。

1.5 分析方法

反應(yīng)過(guò)程中每隔一段時(shí)間取出10 mg樣品，將其溶解在1 mL氯仿中，然后采用配有離子火焰檢測(cè)器的氣相色譜（Model 3800; Varian, Palo Alto, CA）進(jìn)行分析。起始時(shí)柱溫為120℃，3 min后以20℃/min的速率升溫至370℃，保持5 min。所用氣體為氦氣，流速1.5 mL/min。進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度均保持在370℃。酰基甘油、脂肪酸乙酯和游離脂肪酸的量通過(guò)氣相色譜測(cè)定。由于游離脂肪酸和脂肪酸乙酯無(wú)法通過(guò)氣相色譜實(shí)現(xiàn)分離，游離脂肪酸的量可通過(guò)酸堿中和滴定測(cè)量，用0.1 摩爾當(dāng)量的KOH滴定脂肪酸，以堿性藍(lán)（Merck Chemical, Darmstadt, Germany）作為指示劑。脂肪酸乙酯的產(chǎn)率可通過(guò)下式計(jì)算獲得

a為反應(yīng)物中脂肪酸乙酯的質(zhì)量，b是反應(yīng)物中脂肪酸乙酯、游離脂肪酸和?；视偷目傎|(zhì)量。

反應(yīng)物中的水含量通過(guò)Karl-Fisher水分測(cè)量?jī)x（Model 870 KF Titrino plus; Metrohm AG; Herisau,Switzerland）監(jiān)測(cè)。

1.6 擬合模型

按照固定化酶失活模型分別對(duì)對(duì)照工藝和改進(jìn)工藝中的生物催化劑的半衰期進(jìn)行擬合。為了確定每一個(gè)模型的相關(guān)性系數(shù)，對(duì)固定化酶的測(cè)量半衰期與估算半衰期的偏差進(jìn)行了最小化處理。根據(jù)下面的殘余活性方程計(jì)算酶的估算半衰期：

其中k是反應(yīng)速率常數(shù)（1/time），t是反應(yīng)物滯留時(shí)間（h）。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始水含量的影響

長(zhǎng)久以來(lái)，水含量一直被認(rèn)為是維持酶活性的重要因素。少量水的存在對(duì)維持酶的活性是十分有利的；但是，過(guò)量的水往往會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的平衡偏離酯交換，而傾向于水解。每一種酶都有各自維持最佳活性所需要的最佳水含量，這與每一種酶的特性是密不可分的。當(dāng)酶被固定化時(shí)，載體對(duì)水的親和力也將影響酶的催化活性。因此，最佳水含量與所用的載體也是密切相關(guān)的。嗜熱菌脂肪酶分解脂肪的反應(yīng)在接近無(wú)水的條件下的反應(yīng)速率是非常低的。相比較而言，提取自Candida antarctica的脂肪酶(Novozym 435)卻在水含量非常低的情況下展現(xiàn)出很高的催化活性。

圖2 初始的水含量對(duì)經(jīng)過(guò)Lipozyme TL IM 催化酸性油與乙醇的酯交換反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的影響

由于水含量會(huì)對(duì)酶的幾何結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型產(chǎn)生影響，因此，以酶作催化劑的填充床反應(yīng)器中水分的含量通常對(duì)酶的穩(wěn)定性、活性和選擇性產(chǎn)生顯著影響。如何準(zhǔn)確測(cè)量水分含量就成為了酶催化用填充床反應(yīng)器設(shè)計(jì)中必須解決的問題之一。圖2顯示了初始的水含量對(duì)經(jīng)過(guò)Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇的酯交換反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的影響。水含量為以反應(yīng)物為基準(zhǔn)的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，考察范圍為0～6 %，其他反應(yīng)條件保持不變（30℃，酸性油/乙醇=1:5）。由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率隨著水含量從0增加4%而逐漸增大。盡管如此，當(dāng)水含量超過(guò)4%以后，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率卻基本保持不變。水含量為0時(shí)，脂肪酸乙酯的最大產(chǎn)率只有約20%。這主要是因?yàn)樗康脑龃髮⑻岣呙复呋夥磻?yīng)的速率，并可能影響了醇解反應(yīng)的酶的活性。在酶催化三油酸甘油酯的醇解實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。當(dāng)用嗜熱菌脂肪酶作為催化劑時(shí)，醇解反應(yīng)在無(wú)水條件下的反應(yīng)極其緩慢。這是因?yàn)橹久赣蟹浅４蟮南拗茀^(qū)域和界面活化作用，與較大的構(gòu)型變化密切相關(guān)。

當(dāng)水含量為4%時(shí)，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率在4 h內(nèi)可以達(dá)到最大，約90%。因此，最佳水含量為4%。

2.2 溫度的影響

由于酶的活性和選擇性對(duì)溫度非常敏感，因此，研究溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響十分必要。雖然溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活，但是升高溫度通常會(huì)帶來(lái)一個(gè)加速效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)固定水含量為4 %和酸性油與乙醇的摩爾比為1:5，考察了溫度在0～40℃范圍內(nèi)變化時(shí)，對(duì)經(jīng)Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇酯交換反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度從0升至30℃，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率不斷增大。繼續(xù)升高溫度，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率不再增大，反而快速下降。特別是40℃時(shí)，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率在反應(yīng)的前2 h內(nèi)持續(xù)增大，但是隨后開始下降。這可能是由于酶的醇解活性在40℃時(shí)喪失造成的。盡管Lipozyme TL IM被認(rèn)為在酸解和酯交換反應(yīng)中是耐高溫的，但是在乙醇存在下Lipozyme TL IM在40℃以上通常會(huì)發(fā)生不可逆變性。有文獻(xiàn)報(bào)道Lipozyme TL催化天然棕櫚油與甲醇酯交換反應(yīng)時(shí)，脂肪酸酯的產(chǎn)率會(huì)隨著溫度的升高而下降，特別是當(dāng)溫度高于40℃以后。Dizge等也報(bào)道了Lipozyme TL催化菜籽油與甲醇酯交換反應(yīng)時(shí)，隨著溫度從40℃升高至70℃脂肪酸酯的產(chǎn)率將從85.8%降低至21.1%。這通常被歸因于酶在溫度超過(guò)40℃后的不可逆變性。

由于脂肪酸乙酯在20℃和30℃時(shí)所能達(dá)到的最大產(chǎn)率沒有明顯差異，所以，從節(jié)能的角度考慮，實(shí)驗(yàn)選擇20℃作為反應(yīng)溫度。

圖3 濕度對(duì)酶催化反應(yīng)中脂肪酸乙酯的產(chǎn)率的影響

2.3 物料配比的影響

固定水含量為4 %和反應(yīng)溫度為20℃，實(shí)驗(yàn)考察了酸性油與乙醇的摩爾比在1:3 ～1:6范圍內(nèi)變化時(shí)，對(duì)經(jīng)Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇酯交換反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的影響，結(jié)果見圖4。當(dāng)摩爾比為1:3時(shí)，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率在反應(yīng)進(jìn)行4 h后達(dá)到平衡，大約78%。此時(shí)，反應(yīng)速率比摩爾比為1:4和1:6時(shí)慢。當(dāng)摩爾比為1:4和1:6時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率幾乎一致。Corrêa等認(rèn)為酯交換反應(yīng)產(chǎn)率的下降是由于過(guò)量醇的存在，導(dǎo)致酶的活性降低所引起的。因此，在高濃度醇存在下，酶活性和酯交換反應(yīng)產(chǎn)率的下降很好地反映了醇對(duì)水分子與固定化酶的構(gòu)想之間相互作用的干擾，從而破壞了酶的活性和穩(wěn)定性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酸性油與乙醇的摩爾比為1:4作為最佳物料比。此時(shí)，脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為92%，其余為3%脂肪酸和5%?；视?。

根據(jù)以往的研究可知，Lipozyme TL IM是一種1,3-配位的脂肪酶，它可以水解三酰甘油中1位和3位的酯鍵，故理論上的最達(dá)產(chǎn)率為66.67 %。但是我們卻獲得92%的產(chǎn)率，這是因?yàn)樗嵝杂椭泻写罅坑坞x脂肪酸（約54%），它們可以完全轉(zhuǎn)化為脂肪酸乙酯。

圖4 酸性油與乙醇的摩爾比對(duì)于經(jīng)Lipozyme TL IM 催化酸性油與乙醇酯交換反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的影響

2.4 固定化酶的重復(fù)利用

固定化酶的最大優(yōu)勢(shì)就是其穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性。固定化酶的使用壽命已然成為評(píng)價(jià)工藝經(jīng)濟(jì)成本的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)考察了最佳工藝條件（水含量為4%，反應(yīng)溫度為20℃，酸性油與乙醇的摩爾比為1:4，反應(yīng)物滯留時(shí)間4 h）下，Lipozyme TL IM在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)化酯交換反應(yīng)過(guò)程的穩(wěn)定性，并且對(duì)比研究了在兩種不同的填充床反應(yīng)工藝中甘油的抑制作用，結(jié)果見圖5。第一個(gè)工藝作為對(duì)照體系，對(duì)反應(yīng)中生成的甘油不作任何處理。相比之下，第二個(gè)工藝中加入一個(gè)間歇性洗滌操作單元。每循環(huán)生產(chǎn)12次(48 h)后，用乙醇將甘油除去。在這兩種工藝中，固定化脂肪酶均保持了其對(duì)脂肪酸乙酯的高催化活性，即使進(jìn)行了18次循環(huán)后。但是，如果進(jìn)一步增大循環(huán)次數(shù)，從18次增加到27次，控制對(duì)照工藝中酶的相對(duì)活性降低較大，為66%；然而，增加了乙醇沖洗操作的工藝中酶的活性降低較小，依然可以達(dá)到82%?？刂茖?duì)照工藝中，Lipozyme TL IM的半衰期為39次循環(huán)，而乙醇沖洗工藝中Lipozyme TL IM的半衰期為45次循環(huán)。通過(guò)酶失活模型估算得到的在兩種工藝中Lipozyme TL IM半衰期分別為40.5次循環(huán)和45次循環(huán)。二者的吻合度非常好。

當(dāng)酶被連續(xù)使用后，它的相對(duì)活性會(huì)有所降低。作為三酰甘油與乙醇酯交換反應(yīng)的產(chǎn)物，甘油是其中最重要的原因所在，它已經(jīng)被確認(rèn)是一種酶抑制劑。Salis等人對(duì)此給出了可能的抑制作用機(jī)理。首先，甘油在酶表面的吸附導(dǎo)致了酶中所含水的活度降低。其次，甘油在酶表面形成的吸附層阻礙了疏水反應(yīng)物向酶的活性位點(diǎn)的擴(kuò)散。Li等也報(bào)道了在無(wú)溶劑法酶催化制備脂肪酸乙酯工藝中，大量甘油被吸附在固定化脂肪酶的表面，導(dǎo)致了酶的使用壽命的縮短。Watanabe等認(rèn)為甘油可以擾亂反應(yīng)物向酶的擴(kuò)散，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率隨著未反應(yīng)醇濃度的增大而降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了酯交換反應(yīng)中生成的甘油抑制了Lipozyme TL IM的反應(yīng)活性。盡管如此，用乙醇對(duì)生物催化劑進(jìn)行間歇性沖洗可以從填充床反應(yīng)器中有效地去除甘油，從而提高酶的使用壽命。

圖5 Lipozyme TL IM在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行催化酯交換反應(yīng)過(guò)程的相對(duì)活性

3 結(jié)論

以Lipozyme TL IM作為催化劑，在填充床反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了從米糠油皂腳酸化制得的酸性油和乙醇的酯交換反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的高效合成。水含量、反應(yīng)溫度和物料比對(duì)脂肪酸乙酯的產(chǎn)率有顯著影響。通過(guò)乙醇沖洗可以明顯提高脂肪酶的相對(duì)活性。

（譯自《J Am Oil Chem Soc》19 January 2016）

Synthesis of Fatty Acid EthyI Ester from Acid OiI in a Continuous Reactor via an Enzymatic Transesterification

Nakyung Choi1,2· Yangha Kim3· Jeom?Sig Lee4· Jieun Kwak4· Junsoo Lee5·In?Hwan Kim1,2

Synthesis of a fatty acid ethyl ester via the lipase-catalyzed transesterification of acid oil and ethanol was investigated in a continuous reactor. Lipozyme TL IM was employed as the immobilized lipase. This immobilized lipase derived from Thermomyces lanuginosus was purchased from Novozymes (Seoul, Korea). The acid oil was prepared by the acidification of soapstock formed as a byproduct during the refining of rice bran oil. The parameters investigated were water content,temperature, and molar ratio of substrates. The relative activity of Lipozyme TL IM was assessed during the repeated use of the immobilized lipase. The water content of the substrate had a considerable effect on the yield and the optimum water content was 4 %. The optimum temperature and molar ratio of acid oil to ethanol were 20 °C and 1:4, respectively. The maximum yield of approximately 92 % was achieved under the optimum conditions. The corresponding compositions were 92 % fatty acid ethyl esters, 3 % fatty acids, and 5 % acylglycerols. When glycerol formed during the reaction was removed by intermittent washing with ethanol, the relative activity of lipase was maintained over 82 % for a total usage of 27 cycles. For a mean residence time of 4 h, the half-life times of Lipozyme TL IM on the control (unwashed) and treatment (washed) were 39 and 45 cycles, respectively.

acid oil; biodiesel; continuous reactor; fatty acid ethyl ester; thermomyces lanuginosus lipase; transesterification