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        金納米粒子動態(tài)光散射技術的應用研究進展

        2017-12-27 02:42:58周寶青占忠旭許恒毅
        分析測試學報 2017年12期
        關鍵詞:功能化堿基檢出限

        周寶青,占忠旭,黃 楠,李 凡,許恒毅

        (南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047)

        金納米粒子動態(tài)光散射技術的應用研究進展

        周寶青,占忠旭,黃 楠,李 凡,許恒毅*

        (南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047)

        動態(tài)光散射(Dynamic light scattering,DLS)作為顆粒粒徑分析方法,具有免分離、易操作、檢測成本低、數據易處理等優(yōu)點;功能化的金納米粒子除具有本身粒子屬性外,還能特異性識別待檢物,明顯放大檢測物光散射信號,可通過DLS技術快速、特異、靈敏檢測目標物。該文綜述了金納米粒子DLS技術在目標物分析與檢測中應用的研究進展,并對動態(tài)光散射技術在應用過程存在的問題進行了討論,旨在為其實際應用提供一定參考。

        金納米粒子;動態(tài)光散射技術;檢出限;樣本檢測;綜述

        動態(tài)光散射(Dynamic light scattering,DLS)是一種常規(guī)的分析技術,廣泛應用于粒子粒徑大小及分布情況的分析[1]。自1970年起,該方法已作為一種實用的分析方法應用于目標物分析和檢測[2]。商業(yè)化的常規(guī)DLS檢測設備雖然具有易于操作、檢測成本低、數據處理容易等優(yōu)點[3],但存在檢測靈敏度低、特異性差等缺點,限制了其在實際樣品檢測中的應用。納米材料(金、銀、量子點等)作為理想的光散射增強劑,經過修飾后能顯著增強DLS信號[4-5],其中金納米粒子(AuNPs)因其特殊的物理化學性質(高摩爾消光系數、表面增強拉曼散射等)和良好的生物相容性得到越來越多研究者的青睞[6]。通過靜電吸附、Au—S或Au—N鍵等作用,蛋白質、核酸、無機物等可穩(wěn)定修飾在AuNPs表面構建功能化金探針,將其與DLS技術結合,應用于樣品檢測,具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點。本文綜述了基于AuNPs的DLS技術的檢測原理及其在樣品檢測中的應用進展,并對其存在的問題進行了討論,旨在為實際應用提供參考。

        圖1 動態(tài)光散射實驗裝置圖Fig.1 The experimental equipment of DLS

        1 動態(tài)光散射技術測量顆粒直徑的原理

        DLS技術又稱時間相關的光散射技術[7],是一種實時監(jiān)控待檢物散射光強度變化的技術。由于待檢物溶液中的分子不停地做布朗運動,其粒子散射光的相位發(fā)生變動,導致散射光強度在時間上表現(xiàn)為在平均光強附近的隨機波動。研究表明,粒子散射光強度的漲幅頻率與其粒徑相關,粒徑越大,漲落越慢[8]。因此,通過測量散射光強度的漲落變化或頻移情況,可同時獲得顆粒粒徑的相關動態(tài)參數,進而計算出粒子的粒徑,其測量范圍為1 nm~5 μm[8]。圖1為動態(tài)光散射實驗裝置圖,其基本流程為:在固定散射角下,聚焦后的激光照射樣品池中的顆粒,顆粒發(fā)出的散射光通過光探測器輸出相應光信號,經過放大/甄別器和相關器處理,得到顆粒光強自相關函數,最后經計算機處理即可獲得顆粒水化粒徑及其分布情況。

        2 金納米粒子動態(tài)光散射技術在目標物分析與檢測中的應用

        AuNPs-DLS技術是利用功能化AuNPs探針特異性捕獲目標物,AuNPs發(fā)生聚集導致其粒徑變化,采用DLS技術實時、靈敏、分析其變化情況,從而定量檢測目標物[11]。

        根據AuNPs探針聚合方式的不同,基于AuNPs-DLS技術建立的常見檢測方法主要可分為直接聚合法與間接聚合法兩類。直接聚合法是利用功能化修飾AuNPs探針特異性識別目標物聚集,結合DLS進行分析的檢測方法,主要利用的聚合方式包括抗原抗體反應、堿基互補配對、核酸適配子特異性識別等。該類方法檢測時間短、特異性好、靈敏度高,廣泛用于蛋白質[12]、核酸[13]和食源性致病菌[14]的檢測。間接聚合法是指通過目標物所帶電荷破壞AuNPs之間的靜電平衡導致AuNPs聚集,結合DLS進行間接分析的方法,其主要利用的聚合方式為靜電相互作用。相比直接聚合法,該類方法檢測時間更短、成本更低,主要用于環(huán)境中重金屬離子的檢測[15],但其檢測靈敏度較低、特異性較差。圖2歸納了近年來功能化金納米粒子不同聚合方式結合DLS技術在目標物檢測中應用的原理,表1總結了AuNPs-DLS技術在樣品檢測中的應用。

        圖2 功能化金納米粒子的聚合方式Fig.2 The aggregation methods of functionalized AuNPsA.antigen-antibody reaction(基于抗原-抗體反應);B.complementary base pairing(基于堿基互補配對);C.aptamer specific recognition(基于核酸適配子特異性識別);D.electrostatic interaction(基于靜電相互作用)

        表1 AuNPs-DLS技術在不同樣本檢測中的應用Table 1 The application of AuNPs-DLS technology for the detection of different samples

        (續(xù)表1)

        MethodApplicationCombinationAdvantageDisadvantageTargetLimitofdetectionReferenceDNA修飾的AuNPs-DLS技術堿基互補配對特異性、重復性好,靈敏度高等DNA修飾不穩(wěn)定、目標物結合不可控單鏈DNA0 1pmol/L[18]雙鏈DNA593fmol/L[19]核酸適配子功能化AuNPs-DLS技術核酸適配子特異性識別與目標物結合效率高、特異性好、受環(huán)境影響小特異性核酸適配子篩選復雜、探針合成不穩(wěn)定腺苷7nmol/L[20]三聚氰胺2 0mg/mL[21]間接聚合法基于靜電相互作用AuNPs-DLS技術靜電相互作用操作簡單、無需修飾、檢測靈敏度高特異性較差、受環(huán)境影響因素較大Hg2+0 43nmol/L[22]Pb2+6 2pmol/L[23]

        2.1 直接聚合

        2.1.1基于抗原-抗體反應作為一種高效、特異的生物學捕獲方式,抗原抗體反應廣泛應用于生物傳感器檢測方法中。通常,功能化探針通過抗原抗體反應特異性識別目標物并發(fā)生聚集,利用DLS技術可定量檢測[24]?;诳乖贵w反應聚合方式的AuNPs-DLS檢測方法因高效、靈敏、特異等優(yōu)點已被廣泛應用在臨床診斷、疾病預防、食源性致病菌檢測等方面。Liu等[16]首先合成了抗體包被的不同形狀AuNPs探針,構建一步均相雙抗夾心模式特異捕獲前列腺特異抗原,結合DLS技術實現(xiàn)定量檢測,該方法無需分離、樣品用量少,檢出限為0.5 ng/mL。為了進一步提高前列腺特異抗原的檢測靈敏度,Li等[17]通過逐步偶聯(lián)法分別將聚乙二醇、二氧化錳及抗前列腺結合抗體修飾到AuNPs表面,形成“Ab2-MnO2-pGNPs”聚合物探針,與目標抗原特異性結合后固定在96孔板中,利用DLS技術進行檢測,其檢出限為1 fmol/L,相比之前的檢測方法,其靈敏度提高了4個數量級。Huang等[14]首次建立了基于免疫磁富集和多抗修飾AuNPs探針的DLS技術定量檢測食源性致病菌的方法。該方法檢測時間短,能特異性捕獲生菜中的單增李斯特菌,回收率為74.4%~123.4%,在實際加標樣品中的檢出限為22 CFU/g。

        2.1.2基于堿基互補配對DNA是一類帶有遺傳信息的生物大分子,DNA之間嚴格按照堿基互補配對原則進行組裝形成功能化結構。在核酸檢測過程中,基于堿基互補配對原則設計的核酸修飾的AuNPs探針,能特異識別1個堿基錯配,利用DLS技術分析AuNPs探針聚集后粒徑的微小變化,可達到快速、靈敏、特異的檢測目的。Du等[18]合成了多種單鏈DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)修飾的金探針,當目標DNA存在時,功能化金探針特異捕獲目標DNA發(fā)生聚集,結合DLS技術分析,可實現(xiàn)一步均相檢測靶DNA的目的,其檢測時間短(10 min),最低檢出限為0.1 pmol/L。Dai等[25]首次利用大粒徑AuNPs探針結合DLS技術檢測靶DNA,最低檢出限達1 pmol/L,相比傳統(tǒng)的比色法靈敏度提高了3個數量級。有研究報道,基于堿基互補配對原則,ssDNA除了能形成雙鏈螺旋結構以外,一些特殊堿基序列構成的DNA單鏈還能形成類似于“麻花狀”的三螺旋結構[26-27]?;谌菪Y構DNA的金探針聚合反應是以Double-stranded DNA(dsDNA)為骨架所形成,相比ssDNA,其dsDNA具有制備簡單、保存過程中不易降解等優(yōu)點?;谶@種特殊的三螺旋堿基互補配對原則,Miao等[19]利用只含“G-A”堿基組合的特殊ssDNA合成具有兩種不同ssDNA修飾的AuNPs探針,當靶DNA存在時,通過這種特殊堿基結合方式捕獲靶DNA形成聚合物,利用DLS技術定量檢測dsDNA分子。該檢測方法可特異性識別1個堿基錯配,其靈敏度高,檢出限為593 fmol/L。

        2.1.3基于核酸適配子特異性識別核酸適配子是一類通過體外篩選技術(SELEX)經過反復篩選得到的一段與靶物質有高親和力與特異性的寡核苷酸,不僅擁有類似單克隆抗體功能,而且具有成本低、熱穩(wěn)定性好、環(huán)境耐受能力強等特點[28]。近年來,基于核酸適配子特異識別的AuNPs探針結合DLS檢測技術因操作簡單、靈敏度高、特異性好、適應性強等優(yōu)點,主要用于疾病診斷、食品安全檢測[29]等領域。Yang等[20]首先合成“劈開型”腺苷核酸適配子包被的AuNPs探針,功能化的AuNPs探針特異性捕獲腺苷受體形成腺苷-適配子聚合物,通過DLS技術分析聚合物的粒徑變化,定量檢測腺苷的濃度,檢出限為7 nmol/L,相比傳統(tǒng)的比色法,提高了5個數量級;與抗體功能化探針相比,該探針合成成本低、環(huán)境耐受能力強。Wu等[21]合成了含特定堿基序列的ssDNA功能化AuNPs探針,通過氫鍵的結合作用,該ssDNA上特定的胸腺嘧啶六聯(lián)體結構與三聚氰胺單體分子特異性結合形成多聚體,利用DLS技術分析多聚物粒徑變化,從而快速、靈敏檢測三聚氰胺。該方法檢測三聚氰胺耐受環(huán)境(溫度、pH值、食品基質)的干擾,檢出限最低可達2.0 mg/mL。

        2.2 間接聚合

        靜電相互作用是維持膠體體系穩(wěn)定的主要作用,主要包括靜電引力和靜電斥力。均相膠體溶液中,粒子之間因表面所帶同性電荷相互排斥而保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。實際應用中,未修飾的AuNPs探針處于高濃度鹽(NaCl)緩沖溶液中,其表面的電層被破壞,粒子之間的靜電斥力變弱,AuNPs探針之間發(fā)生聚合,而一些待檢目標物具有穩(wěn)定AuNPs的作用,如ssDNA在伸展狀態(tài)下通過Au—N鍵包被在AuNPs表面,使其保持良好的分散性[30]?;陟o電相互作用的AuNPs探針結合DLS技術因操作簡單、無需修飾、檢測成本低等優(yōu)點而廣泛應用于重金屬離子的檢測。Xiong等[22]成功構建了基于AuNPs探針DLS技術靈敏檢測Hg2+的生物傳感器。未經修飾的AuNPs直接加入反應體系,當不存在Hg2+時,AuNPs由于ssDNA的保護作用保持穩(wěn)定狀態(tài)[5];而Hg2+存在時,Hg2+與ssDNA發(fā)生特異性結合,其ssDNA構象發(fā)生變化形成發(fā)卡結構、二聚體等,此時AuNPs探針裸露在高鹽溶液中發(fā)生明顯聚合,結合DLS技術分析聚合物的粒徑變化可定量檢測Hg2+。該方法無需合成功能化AuNPs探針,其最低檢出限為0.43 nmol/L。Miao等[23]利用Pb2+特異識別dsDNA發(fā)生聚合,同樣構建了基于靜電相互作用AuNPs探針結合DLS技術一步檢測Pb2+的方法,該方法特異性好,能很好地應用于實際水樣中Pb2+含量的檢測,最低檢出限達6.2 pmol/L,回收率為95.12%~104.76%。與傳統(tǒng)比色法相比[31],該方法檢測靈敏度更高;相比電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)等定量分析方法[32-33]的檢測成本更低,操作更快速便捷。

        3 總結與展望

        AuNPs結合DLS技術的檢測方法具有操作便捷、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點,在臨床診斷、疾病預防、食源性致病菌檢測、環(huán)境監(jiān)測等領域得到了廣泛的應用。通過比較不同聚合方式AuNPs結合DLS技術在樣本檢測中的應用發(fā)現(xiàn),該方法在實際應用中尚存在一些問題,需要不斷研究和改進:①盡管AuNPs結合DLS技術能靈敏檢測目標物,但反應體系中復雜基質的存在易造成假陽性結果,因此可結合一些富集手段(如免疫磁富集技術)去除體系中的雜質干擾,從而更加精確地檢測目標物[34];②目前報道的AuNPs結合DLS技術用于樣本的檢測均通過功能化金探針直接或間接捕獲待檢物,其檢測靈敏度受到一定的限制,可結合雜交鏈式反應(HCR)、構建人工模擬酶等信號放大方式進一步提高靈敏度;③目前,AuNPs結合DLS的生物傳感器方法主要利用AuNPs作為捕獲探針載體,形式較為單一,有文獻報道結合多種納米材料或金屬材料的檢測方法,其檢測信號強度能明顯增大[8]。因此,在今后的研究中,可以嘗試結合多種納米材料如磁珠、量子點[35]、銀納米粒子等用于樣品檢測的研究,從而實現(xiàn)超靈敏檢測。隨著檢測技術向快速簡便、高靈敏度方向發(fā)展,基于AuNPs-DLS技術的生物傳感器方法必將得到更廣泛的關注與應用。

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        Research Progresses on Application of Dynamic Light Scattering with Gold Nanoparticles

        ZHOU Bao-qing,ZHAN Zhong-xu,HUANG Nan,LI Fan,XU Heng-yi*

        (State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

        Dynamic light scattering(DLS),as a conventional analysis method by particle size,has the advantages of free separation,easy operation,low test costs and easy data processing etc.Functionalized AuNPs,in addition to thier own particle properties,could also specifically identify the target,significantly amplify the light scattering signals from the target,and ultimately achieve a fast,specific and sensitive detection on the target through the DLS technique.In this paper,research progresses on the application of DLS with gold nanoparticles in detection on the target were reviewed.Some problems in the application process of DLS technique were discussed,which was intended to provide some reference for its practical application.

        AuNPs;dynamic light scattering;limit of detection;sample detection;review

        2017-05-15;

        2017-06-20

        江西省青年科學家(井岡之星)培養(yǎng)對象項目(2014BCB23004)

        *

        許恒毅,博士,副研究員,研究方向:食品生物技術,Tel:0791-88304447-222-9520,E-mail:kidyxu@163.com

        10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.020

        O433.4;G353.11

        A

        1004-4957(2017)12-1536-05

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