李 鳳，管月清，張艷梅，康經(jīng)武

(1.西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065；2.生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海 200032;3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 200032)

中藥多糖及人血清中糖蛋白N-糖鏈的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究

李 鳳1*，管月清2，張艷梅3，康經(jīng)武2

(1.西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065；2.生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海 200032;3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 200032)

該文建立了激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳(CE-LIF)檢測中藥多糖和人血清糖蛋白中N-糖鏈的分析方法。利用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鈉(APTS)為柱前熒光衍生試劑，結(jié)合CE分析，可在15 min內(nèi)同時測定7種中性單糖。該方法應(yīng)用于中藥制劑和藥物植物中單糖組成和含量的測定，加標(biāo)回收率為88.0%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.0%。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、實用可靠，適合于監(jiān)控中藥制劑中糖類物質(zhì)的種類和含量。同時，基于毛細(xì)管凝膠電泳方法(CGE)建立了人血清中糖蛋白的N-糖鏈指紋圖譜。利用中性涂層聚乙烯醇(PVA)有效地抑制電滲流，增加分離時間，實現(xiàn)了糖鏈異構(gòu)體的有效分離。對5 μL 人血清進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，共分離得到17個組分。這為進(jìn)一步研究復(fù)雜生物體系血清蛋白的糖基化變化提供了可能性。

激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳；中藥多糖；N-糖基化修飾；糖蛋白

糖類化合物是能量的主要來源，同時也是重要的功能分子。其中，多糖和糖蛋白是糖類化合物常見的兩種存在形式。研究證實，多糖特別是水溶性多糖具有重要的生理活性，如抗腫瘤、抗炎、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)功能等，是中藥的重要功效成分之一[1]。而在真核生物中，蛋白糖基化是一類重要的蛋白翻譯后修飾形式。糖蛋白中糖鏈不僅影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，而且在分子識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫應(yīng)答等生物過程中也發(fā)揮重要作用[2]。不論是中藥多糖還是糖蛋白中的糖鏈，其結(jié)構(gòu)特征如相對分子質(zhì)量及其分布、單糖組成以及連接順序等與活性密切相關(guān)[3-4]。因此，對糖類化合物的結(jié)構(gòu)表征為中藥的質(zhì)量控制和糖蛋白的功能研究提供了重要線索。

由于糖類化合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，其分離是分析化學(xué)研究的難點(diǎn)之一[5-6]。毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)具有分離效率高、樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜糖鏈結(jié)構(gòu)表征中具有很大的應(yīng)用潛力[7]。Karger等[8]報道了基于CE和激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測的糖鏈檢測方法，7 min內(nèi)實現(xiàn)了免疫球蛋白G(IgG)中12種糖鏈異構(gòu)體的高效分離，并將該方法成功應(yīng)用于單克隆抗體類藥物糖型表征，為抗體類藥物的質(zhì)量控制提供了簡單、快速、靈敏的分析方法。近年來，膠束毛細(xì)管電泳(MEKC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)及毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)等多種電泳模式也被用于多糖及單糖的分離檢測中，分析對象主要集中于植物多糖、單克隆抗體類藥物等[9-13]。王文波等[11]利用毛細(xì)管電泳對原研體CD20人鼠嵌合單抗和4個生物類似藥的N-糖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在單抗的質(zhì)量控制中，應(yīng)重視N-糖鏈檢測的重要性。但對于復(fù)雜生物體系中糖蛋白的糖類化合物的結(jié)構(gòu)表征報道較少。Callewaert課題組利用ABI 3030 DNA測序儀，建立了血清N-糖鏈簡單、快速的檢測方法，并進(jìn)一步結(jié)合微流控芯片技術(shù)，大大縮短了分析時間，已應(yīng)用于肝癌患者血清糖蛋白的糖型分析[14-15]。

本文采用熒光衍生試劑8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鈉(8-Aminopyrene-1,3,6- trisulfonic acid,APTS)對糖類化合物進(jìn)行柱前衍生，采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)，利用硼酸鹽與單糖衍生物的鰲合作用，15 min內(nèi)實現(xiàn)了7種中性單糖的高效分離。該方法成功應(yīng)用于中藥制劑和藥物植物中單糖組成和含量的測定。同時采用毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)建立了人血清中N-糖鏈的指紋圖譜。本研究利用聚乙烯醇(PVA)中性涂層，有效地抑制了電滲流，增加了分離時間，實現(xiàn)了糖鏈異構(gòu)體的高效分離。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ CE系統(tǒng)配LIF檢測器(美國Beckman Coulter公司)，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm。彈性石英毛細(xì)管柱50 μm i.d.，360 μm o.d.(Polymicro Technologies公司，USA)。Agilent 7820A氣相色譜儀。聚乙烯醇(PVA)中性涂層毛細(xì)管柱(實驗室自制)。8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鈉鹽(APTS)購自Invitrogen公司(USA)；葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、麥芽糖(Mal)、氰基硼氫化鈉、熒光素鈉(fluorescein sodium，F(xiàn)S)、三乙胺、乙腈、乙酸、無水乙醇(分析純)、四氫呋喃(分析純)、聚乙烯醇(PVA)、人血清均購自Sigma公司。肽N-糖苷酶(PNGase F)購自New England Lab。Glyko?APTS-(Maltodextrin Ladder) 購自美國Prozyme公司。硼砂(分析純)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純)、氫氧化鈉(分析純)購自上海實生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司。中藥注射液(熱毒寧注射液)與純化后的藥用植物多糖樣品(金銀花多糖)均由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。實驗用水為18 MΩ·cm超純水(Millipore超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司)。溶液使用前需用0.22 μm濾膜過濾。

1.2 樣品前處理溶液的制備

精確稱取藥用植物多糖，水溶、渦旋，預(yù)配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，13 400 r/min離心5 min后取上清液備用。準(zhǔn)確移取中藥注射液及藥用植物多糖樣品各1 mL，分別加入4 mol/L鹽酸1 mL，渦旋混勻后，80 ℃下密封反應(yīng)6 h。冷卻至室溫后，N2吹干，再加1 mL 超純水溶解水解樣品，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人血清樣品用3 kDa 超濾管處理以去除低分子量組分。取人血清樣品5 μL(蛋白質(zhì)量濃度 10 mg/mL)按照NEB的試劑盒進(jìn)行樣品前處理：加入10 μL 2% SDS 在60 ℃中孵育10 min使蛋白變性，依次加入5 μL 4% NP-40以及PNGase F 2 μL，37 ℃酶解24 h。加入一定體積的預(yù)冷乙醇，使其終濃度為75%，混勻后，-20 ℃靜置0.5 h，13 400 r/min離心15 min。取上清液冷凍干燥后，溶于5 μL超純水中備用。

1.3 APTS衍生化

分別取葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取0.79 mg APTS，溶于30 μL(4.2 mol/L)乙酸溶液中，配成5.0×10-2mol/L APTS的乙酸溶液；準(zhǔn)確稱取1.9 mg 氰基硼氫化鈉，溶于60 μL四氫呋喃溶液中，配成0.5 mol/L氰基硼氫化鈉的THF溶液。

準(zhǔn)確配制濃度為1.0×10-7mol/L的熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為內(nèi)標(biāo)。取水解后的樣品溶液、酶切后的N-糖鏈及混合單糖各系列溶液5 μL，分別加入2 μL APTS的乙酸溶液與4 μL氰基硼氫化鈉的THF溶液，混合均勻后，于55 ℃下密封反應(yīng)2 h。對于含有唾液酸的糖鏈，37 ℃下過夜衍生。避光冷卻后稀釋至100 μL，備用。

1.4 PVA 涂層柱的制備

配制6% PVA溶液，超聲脫氣10 min，截取4 m×50 μm i.d.的毛細(xì)管柱。氮?dú)庾饔孟?，向毛?xì)管柱通入6% PVA水溶液，持續(xù)2 h。之后去除未與毛細(xì)管表面結(jié)合的PVA。最后將其置于氣相色譜儀的恒溫箱中，以5 ℃/min程序升溫至145 ℃，保持5 h。

1.5 CE分離條件

中藥多糖的CZE分離條件：裸毛細(xì)管柱40 cm(有效長度29.5 cm)；新毛細(xì)管用0.1 mol/L NaOH溶液活化30 min，再用超純水和背景電解質(zhì)溶液分別沖洗2 min。分離電壓：20 kV；壓力進(jìn)樣：0.3 psi×5 s；柱溫為25 ℃；背景電解質(zhì)為30 mmol/L硼砂緩沖溶液(pH 10.03)。

血清N-糖鏈的CGE分離條件：PVA涂層毛細(xì)管柱50 cm(有效長度39.5 cm)；分離電壓：20 kV；壓力進(jìn)樣：0.3 psi×5 s；柱溫為25 ℃；背景電解質(zhì)為25 mmol/L NH4Ac(pH 4.75)，0.4% PEG 20 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 中藥多糖毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法的建立

2.1.1CZE分離譜圖所分離的7種中性單糖不具備強(qiáng)的紫外或熒光發(fā)色基團(tuán)，給檢測帶來了一定困難。本文選用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鈉(APTS)作為柱前衍生試劑，對熒光衍生后的單糖進(jìn)行分析。圖1為7種單糖混合標(biāo)樣的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖。在30 mmol/L硼砂緩沖溶液(pH 10.03)中，7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在較短時間(15 min)內(nèi)實現(xiàn)了基線分離。實驗選用熒光素鈉作為內(nèi)標(biāo)，可對衍生后各單糖的峰面積進(jìn)行校正，從而提高定量的準(zhǔn)確性。

圖1 單糖混合標(biāo)樣的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖Fig.1 Electropherogram of seven monosaccharide standards1. FS；2.Mal；3.Rha；4.Man；5.Glu；6.Xyl；7.Ara；8.Gal

2.1.2緩沖液及pH值對糖分離的影響考察了磷酸-磷酸二氫鈉、Tris-磷酸、醋酸-醋酸鈉、硼砂-磷酸以及硼砂-氫氧化鈉等不同緩沖體系對待測物分離度和遷移時間的影響。結(jié)果表明：由于硼酸鹽能與待測物螯合生成配位陰離子來增加溶解度，僅在硼砂緩沖體系中，可減少因吸附造成的峰拖尾等影響，各組分實現(xiàn)了基線分離。在pH 9.2～11.0范圍內(nèi)研究了pH值對被測物分離度的影響，發(fā)現(xiàn)pH 10.03時各組分能實現(xiàn)基線分離，故最終選擇硼砂-氫氧化鈉緩沖體系(pH 10.03)為運(yùn)行緩沖溶液。

2.1.3方法學(xué)的考察在最優(yōu)的分離條件下，考察了該方法的重復(fù)性。以標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)進(jìn)樣結(jié)果計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，如表1所示，日內(nèi)和日間的RSD均小于3.0%，表現(xiàn)出良好的重復(fù)性。取6種不同濃度的單糖溶液(每種單糖的質(zhì)量濃度均在0.005 ～0.25 mg/L之間)進(jìn)行電泳實驗，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣4～6次，以各化合物的質(zhì)量濃度(X，mg/L)與峰面積(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過回收率驗證方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，7種單糖的線性良好，回收率為88.0% ～ 102%，表明該方法的準(zhǔn)確性較好。

表1 各組分的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及重復(fù)性數(shù)據(jù)Table 1 Linear range,regression equation,correlation coefficient(r2) and repeatability of the analytes

2.1.4中藥多糖特征指紋圖譜的建立與分析取藥用植物及中藥注射液按“1.2”方法處理，經(jīng)APTS衍生化后進(jìn)行CZE分析，記錄多糖水解產(chǎn)物15 min的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖。中藥制劑(以批號150607熱毒寧注射劑為例)與藥用植物多糖(以批號Y Sample 6金銀花為例)水解樣品中糖分離測定的電泳圖譜見圖2。通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，對實際樣品中單糖組分進(jìn)行了測定。其中，熱毒寧注射劑中只檢測出葡萄糖和半乳糖(圖2A)，質(zhì)量濃度分別為27.58、1.97 mg/mL。金銀花中檢測出5種單糖(圖2B)，各單糖的組成比為Man∶Glu∶Xyl∶Ara∶Gal=1.08∶1∶5.14∶2.92∶3.46。對熱毒寧注射液不同批次的中藥制劑按本方法進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，其所含葡萄糖的濃度范圍為2.03～27.58 mg/mL；半乳糖的最高濃度為1.97 mg/mL，部分熱毒寧注射劑不含半乳糖。而對藥用植物金銀花采用不同提取條件分離純化后的多糖按本方法進(jìn)行分析測試發(fā)現(xiàn)，不同提取條件對單糖含量和種類影響較大，有一個樣品中只含有阿拉伯糖。所以，在生產(chǎn)中對藥用植物多糖的日常監(jiān)控顯得十分重要。

2.2 人血清中N-糖鏈指紋圖譜的建立

2.2.1毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)條件的優(yōu)化Maltodextrin Ladder是不同聚合度的葡聚糖混合物，聚合度為1～20。APTS標(biāo)記后常作為復(fù)雜糖鏈電泳分析的外標(biāo)，不同聚合度的寡糖的遷移時間通過擬合多項式分布曲線進(jìn)行相關(guān)分析。然后將遷移時間轉(zhuǎn)化為葡萄糖單元(Glucose units，GUs)，可以作為參考標(biāo)準(zhǔn)校正系統(tǒng)差異，使數(shù)據(jù)更加可靠。每個糖鏈的GU值是可重復(fù)的，GU 值增量的變化可以預(yù)測在原來糖鏈基礎(chǔ)上增加的單糖個數(shù)。

考察了磷酸-磷酸二氫鈉、乙酸、乙酸銨、Tris-乙酸等不同緩沖體系對寡糖鏈的分離度和遷移時間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸銨體系的分離度最好。以不同寡聚度的葡聚糖梯度混合物(Maltodextrin ladder)為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離，對鹽濃度、添加劑的類型及毛細(xì)管柱長進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入聚環(huán)氧乙烷(PEO)有利于分離，特別是對較大的寡糖鏈效果較好。與Mw10000的PEO 相比，Mw20000 PEO的峰形更對稱，半峰寬更小。實驗得到的最優(yōu)背景電解質(zhì)為含有0.4% PEG 20000的25 mmol/L NH4Ac(pH 4.75)，分離電壓為20 kV，柱溫為25 ℃。在上述分離條件下，對葡聚糖的聚合度值(Glucose units，GUs)與各組分電泳遷移時間進(jìn)行相關(guān)分析，通過擬合多項式分布曲線發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.99。

2.2.2人血清中N-糖鏈特征指紋圖譜的建立與分析蛋白的糖基化與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。血清作為人體最重要的體液，在臨床診斷和疾病的監(jiān)控中應(yīng)用廣泛。因此，建立人血清中N-糖鏈的指紋圖譜，是進(jìn)一步實現(xiàn)疾病中N-糖鏈差異性分析的基礎(chǔ)。在優(yōu)化實驗條件下，對人血清中N-糖鏈經(jīng)APTS衍生化進(jìn)行分析(圖3)。由于所有的N-糖鏈均含有1個共同的結(jié)構(gòu)花樣(motif)，稱為核心五糖(Man3GlcNAc2)。因此，N-糖鏈的遷移時間集中在12～24 min，含量最高組分的峰高為7.50 RFU。以相對熒光強(qiáng)度大于0.2作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對相應(yīng)的峰進(jìn)行編號，共得到17個組分。

3 結(jié) 論

本文基于APTS衍生化/CE-LIF分析，建立了中藥中單糖以及人血清中N-糖鏈的指紋圖譜。以硼砂緩沖液為背景電解質(zhì)，15 min內(nèi)實現(xiàn)了7種中性單糖標(biāo)準(zhǔn)品的快速分離，并對中藥制劑及藥用植物多糖中單糖組成、含量進(jìn)行了分析。該方法不僅為中藥注射液中糖類物質(zhì)含量的監(jiān)控提供了一種快速、靈敏、有效的分析方法，也對注射液提取工藝的優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。同時本文采用實驗室自制的中性PVA涂層柱，建立了人血清中N-糖鏈的指紋圖譜。對μL級的血清樣品進(jìn)行電泳分析，初步分離得到了17個N-糖鏈組分。這為探索血清蛋白的糖基化變化提供了分析方法，有望用于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。

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Research on Capillary Electrophoresis Fingerprints of Polysaccharides in Traditional Chinese Medicines and N-Glycome in Human Serum Glycoprotein

LI Feng1*,GUAN Yue-qing2,ZHANG Yan-mei3,KANG Jing-wu2

(1.School of Chemical Engineering,Xi’an University,Xi’an 710065,China;2.State Key Laboratory of Bioorganic and Natural Products Chemistry,Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200032,China;3.Institute for Agri-food Standards and Testing Technology,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 200032,China)

A capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection(CE-LIF) method was developed for the determinations of polysaccharides in traditional Chinese medicines(TCMs) and N-glycome in human serum glycoprotein in this paper.After pre-column derivatized with 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonate(APTS) by reductive amination,the seven monosaccharides were sufficiently separated within 15 min.In the analysis of real samples,the average recoveries for the analytes were all in the range of 88.0%-102% with relative standard deviations(RSDs) lower than 3.0%.The method is sensitive,accurate and reliable,and is suitable for the determination of monosaccharide composition in Chinese medicinal preparation.Meanwhile,fingerprints of N-glycome in human serum were established based on capillary gel electrophoresis(CGE).A poly(vinly alcohol) neutrally coated column was used to suppress the electroosmotic flow which would increase the analysis time,and the excellent separation of glycan isomers was realized.5 μL human sera was analyzed and a total of 17 fractions were isolated(RFU>0.2).The analysis of N-glycan profile has made it possible to research the glycosylation alterations of complex biological fluid.

capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence；polysaccharides from traditional Chinese medicines；N-glycosylation；glycoprotein

2017-06-19；

2017-08-31

西安市科技計劃項目(2016CXWL18)；陜西省教育廳專項科研計劃項目(17JK1127)

*

李 鳳，博士，講師，研究方向：毛細(xì)管電泳與藥物分析，Tel:029-88279060，E-mail:lifeng_sunny@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.017

O657.8；R917

A

1004-4957(2017)12-1516-06