李凌

福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院,福建 南平 353000

中國是最早種植茶葉的國家[1]，茶葉不僅富含礦物質(zhì)元素和蛋白質(zhì)，而且還含有茶多糖以及茶多酚等功能性成分[2]。茶葉在生長過程中極易發(fā)生不同種類的病蟲害，由這些病蟲害引起的一系列問題會使得茶葉的品質(zhì)下降，最終造成茶種植業(yè)嚴重虧損[3]?；瘜W方法是目前我國對茶葉病蟲害治理的主要手段，不僅對茶葉的品質(zhì)造成了影響，還會對生態(tài)環(huán)境造成不可修復的損傷[4]。

我國檢測茶葉農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法（GC）、氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等[5]，這些化學分析方法在重復性以及靈敏度方面具有較大的優(yōu)勢，但設備造價昂貴，樣品前處理要求較高等都是不可忽視的問題，這些缺點使得茶葉大規(guī)模檢測變得較為困難。研究設計一種精密度好、準確度高的檢測方法，對于茶葉的大規(guī)模檢測有著深遠的意義[6]。本文采用SERS技術(shù)快速分析茶葉中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留并結(jié)合快速溶劑前處理的方法[7]。通過乙腈提取茶葉，利用變壓吸附（PSA）和納米竹炭（NBC）去除茶葉中的有機酸和生物堿等熒光物質(zhì)。樣本的基底采用OTR202金納米顆粒作為增強物質(zhì)，采集苯醚甲環(huán)唑以及乙腈溶液的表面增強拉曼光譜，并用SERS檢測含苯醚甲環(huán)唑標準溶液的茶葉樣本，檢出農(nóng)藥殘留樣本的最低濃度，建立農(nóng)藥殘留的預測模型并用偏最小二乘法進行數(shù)值計算，對測得的原始光譜進行預處理，并對理論值進行分析比對，最終得到了適合茶葉大規(guī)模檢測的方法。

1 預測模型的建立

1.1 偏最小二乘法的數(shù)學模型

偏最小二乘法即PLS，是一種常用的多因子分析方法[8]。在利用偏最小二乘法進行數(shù)值計算時，通過交換因變量Y與自變量X的得分，使得被分析成分含量與主成分直接發(fā)生關(guān)聯(lián)。

交互驗證均方根誤差即RMSECV，作為偏最小二乘法的評價指標，常被用來衡量方法的準確性。

RMSECV的計算公式如上所示，其中，n為樣本總數(shù)，yi為第i個樣本的實測值，為第i個樣本的預測值。由公式可知，實測值與預測值的差值越小即得到的RMSECV計算值越小，最后的效果越好。

預測均方根誤差即RMSEP，作為樣本預測能力的評價標準，其數(shù)值大小與預測能力緊密相關(guān)，數(shù)值越大，預測能力越低。

上式為預測均方根誤差的計算公式，其中，yi和^分別為集合中第i個樣本的實測值與預測值。

相關(guān)系數(shù)r用于考察樣本實測值與預測值之間的相關(guān)性，當預測值與實測值之間的相關(guān)性越好時，r值越接近1。

2 試驗方法

2.1 實驗材料與儀器

苯醚甲環(huán)唑標準品（99%，Stanford Chemical），乙酸乙酯（色譜純，天津福晨化工公司），乙腈（色譜純，百靈威科技有限公司），PSA（北京迪馬科技有有限公司），納米竹炭（100 nm，安吉滄海精細化工有限公司），OTR202和OTR103（Opto Trace Technologies），鮮茶葉和干茶葉均取自福建省武夷山市的武夷茶。

K-Sens-532高靈敏度激光拉曼光譜儀（上海復享光學有限公司），Agilent 7890A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司），JOYN-DCY-24S型水浴吹氮儀（上海喬躍電子有限公司），STLH-32低速離心機（天津美特斯試驗機廠）。

2.2 干茶葉樣本制備

（1）將沒有農(nóng)藥殘留（陰性）的武夷茶干茶葉平均分成20份，每份重量保持在15 g左右。

（2）用色譜純的乙腈將苯醚甲環(huán)唑的標準溶液稀釋成20份不同濃度的溶液，每份溶液的體積為50 mL。濃度為0 mg/mL，編號為1；濃度為5 mg/mL，編號為2；濃度為10 mg/mL，編號為3；濃度范圍15～27 mg/mL內(nèi)間隔為3 mg/mL，編號為4～8；濃度范圍28～31 mg/mL內(nèi)間隔為1 mg/mL，編號為9～12；濃度范圍32～42 mg/mL內(nèi)間隔為2 mg/mL，編號為13～18；濃度45 mg/mL，編號為19，濃度55 mg/mL，編號為20。

（3）將配置好的溶液均勻噴灑到干茶葉上，得到20個樣本，干燥后粉碎備用。

2.3 干茶葉樣品前處理的優(yōu)化

PSA用量優(yōu)化：將含有苯醚甲環(huán)唑農(nóng)殘的茶葉提取液均分為3份，分別裝到25 mg、50 mg、75 mg PSA的離心管中，劇烈振蕩5 min后，以4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，將上清液過濾備用。

NBC用量優(yōu)化：經(jīng)苯醚甲環(huán)唑浸泡過的茶葉粉碎后取上層液，分別裝到25 mg、30 mg、35 mg的離心管中，劇烈振蕩5 min，以4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上層液，過濾待測。

2.4 光譜數(shù)據(jù)采集

拉曼光譜：功率250 mW，波長設置為780 nm，積分時間30 s，分辨率為5 cm-1，積分5次求平均值。

液樣：樣品池中分別加入0.5 mL的OTR202、0.05 mL待測樣和0.5 mLOTR103并混合均勻，靜置15 min后采集拉曼信號。

農(nóng)藥殘留氣質(zhì)聯(lián)用：OV-101毛細管柱，程序升溫，柱子初溫80℃，保持5 min，升溫速率10℃/min，終溫250℃，保持15 min；氣化室溫度260℃；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min，進樣量1 μL。

3 武夷茶中殘留的苯醚甲環(huán)唑SERS檢測

3.1 苯醚甲環(huán)唑的普通拉曼光譜和表面增強拉曼光譜

由圖1苯醚甲環(huán)唑標準溶液與乙腈溶液的SERS及普通拉曼光譜圖可知，苯醚甲環(huán)唑與乙腈溶液的普通拉曼光譜圖即b和d，在曲線走勢及出峰位置上大致相同，說明信號峰并非農(nóng)藥殘留產(chǎn)生。苯醚甲環(huán)唑標準溶液的SERS（a）在加入表面增強劑OTR202以及OTR103之后，信號得到增強，出現(xiàn)特征峰。而乙腈溶液的SERS(c)并沒有出現(xiàn)特征峰。

圖1 拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectrum

圖2 不同濃度苯醚甲環(huán)唑溶液的SERS圖Fig.2 SERS diagram of different difenoconazole concentrations

圖2為經(jīng)過預處理之后的不同濃度苯醚甲環(huán)唑溶液的SERS圖，由上至下濃度分別為55 mg/mL，45 mg/mL，32 mg/mL，28 mg/mL，17 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，0 mg/mL。觀察SERS信號可知，SERS信號強度的大小受溶液濃度大小的影響很明顯，當溶液濃度變小時，SERS信號強度也變小，當溶液濃度為55 mg/mL，45 mg/mL，32 mg/mL時，曲線都出現(xiàn)幾個明顯的特征峰，當濃度降低時，特征峰已不再明顯，當濃度大小為5 mg/mL時，特征峰已不再出現(xiàn)，由此可知，SERS能夠檢出苯醚甲環(huán)唑特征溶液的極限濃度為10 mg/mL。

3.2 試驗條件的優(yōu)化分析

不同的提取劑效果不同，在檢測武夷茶中苯醚甲環(huán)唑含量時通常用到的提取劑有乙醚、乙腈以及二氯甲烷。乙醚和二氯甲烷在提取農(nóng)殘時會產(chǎn)生大量的共萃物，效果較差，而在使用乙腈作為提取劑時則不會出現(xiàn)這些情況。在使用SERS方法檢測茶葉中苯醚甲環(huán)唑的含量時，由于苯醚甲環(huán)唑是弱極性物質(zhì)，因此在提取時不需加水，防止茶葉中的水溶性物質(zhì)析出。

圖3 苯醚甲環(huán)唑提取液與標準溶液的SERS圖Fig.3 SERS diagrams of difenoconazole extraction solution and standard solution

由圖3苯醚甲環(huán)唑提取液SERS圖以及苯醚甲環(huán)唑標準溶液SERS圖可知，在苯醚甲環(huán)唑的提取液（a）中并未發(fā)現(xiàn)目標物質(zhì)的信號峰，說明檢測結(jié)果可能被茶葉中的熒光物質(zhì)干擾，使得目標峰并未出現(xiàn)。PSA作為目前市場上使用較多的凈化劑，具有較好的凈化效果，能夠?qū)悠分械挠袡C酸等物質(zhì)有效的去除。在不同PSA用量下，苯醚甲環(huán)唑的拉曼特征峰并未出現(xiàn)，說明拉曼信號受到茶葉基質(zhì)的干擾較大。隨著PSA用量由25 mg一直升到75 mg時，譜圖的基線逐漸趨于平穩(wěn)，漂移現(xiàn)象減弱，當用量為75 mg時，其譜圖與用量為50 mg時譜圖基本一致，說明PSA的最佳用量為50 mg。

相比于普通竹炭，納米竹炭具有多孔性等特性，吸附力較強且表面積更大。隨著NBC用量的增加，基線漂移現(xiàn)象逐漸減弱，當用量為25 mg及30 mg時，并未出現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑的拉曼信號峰，而用量為35 mg時出，出現(xiàn)了苯醚甲環(huán)唑的特征峰。結(jié)果表明，NBC的最佳用量為35 mg。

3.3 茶葉中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的SERS檢測分析與預測

取經(jīng)過處理過的茶葉樣品凈化液，放置到氮吹儀中經(jīng)氮吹后用乙腈定容，定容完成后用氣質(zhì)聯(lián)用儀進行真實值檢測，如表1茶葉中苯醚甲環(huán)唑含量氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果所示。

表1 茶葉中苯醚甲環(huán)唑含量氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果Table 1 GC-MS test results of difenoconazole in tea

在對采集到的光譜數(shù)據(jù)進行分析時，首先采用MSC（多元散射校正）、SNV（標準正態(tài)變量變換）以及一階二階導數(shù)進行預處理，在對處理之后的數(shù)據(jù)建立偏最小二乘（PLS）模型。由表2不同預處理方法建立的PLS模型結(jié)果可知，經(jīng)過MSC和SNV預處理后所建的模型優(yōu)于一階二階導數(shù)，而一二階導數(shù)處理后建立的模型又優(yōu)于原始光譜，且SNV預處理方法效果較好。

表2 不同預處理方法建立的PLS模型結(jié)果Table 2 Results of PLS models built by different pretreatment methods

在驗證方法的準確性時要對不同濃度的苯醚甲環(huán)唑茶葉樣本進行檢測，茶葉樣本經(jīng)前處理之后，采集三次拉曼信號并求得平均值，經(jīng)SNV預處理后，采用PLS模型進行樣本預測并與農(nóng)藥殘留氣質(zhì)結(jié)果相比較，如圖3預測值與真實值所示，發(fā)現(xiàn)茶葉樣本中農(nóng)藥殘留的預測回收率在90～105%之間，真實值與預測值誤差在-10～5%之間，誤差值在可允許的范圍之內(nèi)，與化學分析方法結(jié)果相差不大，說明茶葉中苯醚甲環(huán)唑的含量檢測也可以通過該方法來完成。

表3 預測值和真實值Table 3 Predicted and true values

對樣本進行t檢驗，得到的結(jié)果如表4預測值與參考值樣本t檢驗結(jié)果所示，t取值為-0.435，取其絕對值發(fā)現(xiàn)遠遠小于t0.05,3=3.2565，則表明建立的方法可行，預測值與參考值之間相差不大。

表4 預測值與參考值樣本t檢驗結(jié)果Table 4 Results of forecast and reference values t test

4 結(jié)論

本文利用表面增強拉曼光譜（SERS）技術(shù)，探究了苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留在武夷茶中含量的光譜檢測方法。將苯醚甲環(huán)唑作為目標農(nóng)藥，將農(nóng)藥的標準溶液噴灑在茶葉樣本上，分析苯醚甲環(huán)唑標準溶液SERS的拉曼光譜峰。以乙腈為提取劑，優(yōu)化NBC和PSA的量，尋找到最佳的用量。以苯醚甲環(huán)唑作為目標物質(zhì)采用偏最小二乘法建立武夷茶中農(nóng)藥殘留的預測模型，模型預測回收率為92%～105%，相對誤差最大值為5%，在允許的誤差范圍之內(nèi)。最終的t檢驗結(jié)果表明利用偏最小二乘法建立的預測模型能夠很好的預測目標農(nóng)藥的含量，與參考值之間的差值可忽略，滿足大規(guī)模苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測要求。對苯醚甲環(huán)唑標準溶液的最低檢出濃度為10 mg/mL，農(nóng)藥殘留量滿足國家規(guī)定的殘留限量(GB 2763-2014，10 mg/mL)要求。

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