熊賢榮 歐靜 龍海燕 歐陽嘉暉 熊丹

(貴州大學，貴陽，550025)

干旱脅迫對桃葉杜鵑菌根苗葉肉細胞超微結構的影響1)

熊賢榮 歐靜 龍海燕 歐陽嘉暉 熊丹

(貴州大學，貴陽，550025)

為了探明ERM真菌在干旱脅迫時對桃葉杜鵑葉肉細胞超微結構的影響，在溫室大棚內，采用盆栽控水法對分別接種兩種ERM真菌(TY29、TY35)的桃葉杜鵑1年生幼苗進行干旱脅迫處理，以不接種真菌的為對照，在透射電鏡下觀測不同水分處理下接菌苗與對照苗葉肉細胞超微結構的變化。結果表明:在正常水分條件下，各處理桃葉杜鵑幼苗的葉肉細胞結構相同，細胞完整。隨著干旱程度的加深，各處理細胞的葉綠體和線粒體的受損程度都逐漸增大，但在相同水分脅迫下，接種ERM菌根真菌的桃葉杜鵑幼苗的線粒體和葉綠體等細胞器的完整程度要高于對照，細胞器受損害程度更小，具有較好的抗旱能力，其中接種TY35對桃葉杜鵑葉肉細胞的作用更明顯。

桃葉杜鵑；ERM真菌；干旱脅迫；超微結構

隨著全球氣候變暖，干旱災害頻繁發(fā)生，植物的生長受到限制，植物如何在干旱環(huán)境中生存正成為研究熱點，有研究表明菌根真菌能與植物根系形成互惠共生體，對植物的生長發(fā)育和抗逆性有積極的影響，在改善植物水分代謝和提高植物耐旱性中發(fā)揮了重要作用[1]。隨著菌根真菌對植物的有益作用被研究的越來越多，其提高植物耐旱性作用也逐漸受到關注。

杜鵑花是我國傳統(tǒng)名花，有“花中西施”的美稱，高山杜鵑是其重要的類別之一，因其花序巨大，色彩鮮艷，株型美觀且葉常綠不凋而深受人們喜愛，可作為園林景觀、庭院栽培和盆花銷售，是城市園林景觀建設的優(yōu)良資源，國內高山杜鵑種質資源豐富，但可應用栽培的種類少。桃葉杜鵑(RhododendronannaeFranch.)是高山杜鵑的代表種，其花色艷麗，花期5—7月，是一種觀賞價值較高的晚花類杜鵑，在景觀應用上有巨大的市場潛力[2]，但其喜涼爽濕潤氣候，耐旱性較弱，制約其引種栽培，而接種杜鵑花類菌根(ERM)，對杜鵑花類植物克服惡劣環(huán)境、加強養(yǎng)分吸收起到重要的作用。歐靜等發(fā)現接種ERM顯著提高桃葉杜鵑幼苗的苗高、地徑、葉面積、主根長和生物量等，同時接種真菌后，桃葉杜鵑種子萌發(fā)時間有所提早，繁殖系數有較大提高[3-4]。本研究采用透射電子顯微鏡對干旱脅迫下桃葉杜鵑幼苗葉肉細胞超微結構進行觀察，并設置不接種菌株的對照組CK，從微觀方面上更加深入了解ERM對植株作用，為ERM提高植物抗旱性研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

供試土壤按照V(腐殖質)∶V(石英砂)=3∶1的比例混勻后,經121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌2 h，滅菌后測得其土壤理化性質為：pH=4.77，有機質質量分數44.15 g/kg，全氮質量分數1.56 g/kg，全磷質量分數0.161 g/kg，有效磷質量分數7.04 mg/kg，堿解氮質量分數268.55 mg/kg，速效鉀質量分數205.91 mg/kg。

供試植物為1年生桃葉杜鵑實生苗。采用播種繁殖，播種方法采用撒播，每盆100粒。供試的2個菌株為前期從野生桃葉杜鵑根系分離并篩選出的綜合促生能力和侵染率較強的2個菌株[4-5]:TY29(AB158314：Trametesochracea)，TY35(AB378554：Pochoniabulbillosa)(括號中前者為國際GenBank中的登錄號，后者為與試驗菌株親緣關系最近種),由課題組分離保存。采用PDA液體培養(yǎng)基對試驗菌株進行培養(yǎng)，置于搖床上28 ℃振蕩(160 r/min)暗培養(yǎng)15 d，打碎并制成液體菌劑備用。

于2015年12月播種后放入人工氣候箱內恒溫培養(yǎng)(晝夜都為25 ℃，濕度90%、光照12 h)。2016年4月，將桃葉杜鵑幼苗移出人工氣候培養(yǎng)箱，移栽至花盆中，每盆移植1株，栽植塑料花盆規(guī)格為90 cm×60 cm×80 cm，每盆裝滅菌土20 g，于2016年4月12日，每株幼苗根部各施入菌液5 mL，CK苗澆5 mL不含菌液的PDA液體培養(yǎng)基。在貴州大學林學院苗圃大棚內進行培育。同一個處理隨機擺放，各處理之間相互隔離，進行常規(guī)育苗方法管理。

1.1 實驗設計

2016年8月選取生長一致的植株進行脅迫處理，每個處理15盆，每盆1株，各處理重復3次。用隨機區(qū)組試驗設計，因素A為接菌處理，設3個處理，分別為TY29、TY35和對照CK；因素B為干旱脅迫處理，設4個脅迫梯度，按正常澆水(土壤含水率80%～90%，作為干旱脅迫的對照) 、輕度干旱(土壤含水率65%～75%) 、中度干旱(土壤含水率50%～60%)、重度干旱(土壤含水率35%～45%)進行處理。每天下午通過稱質量法維持土壤相對含水量保持在試驗設計范圍內，其他管理一致，每天傍晚補足白天損失的水分，連續(xù)處理30 d后測定各指標。

1.2 指標測定

2016年8月對菌根侵率進行測定，植株收獲時菌根侵染率按Phillips[6]方法測定,涉及到的計算公式如下：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段數量/檢測的根段總數量)×100%;

菌根依賴性=(接種植株平均干質量/對照植株平均干質量)×100%；

菌根貢獻率=((接種植株平均干質量-不接種植株平均干質量)/接種植株平均干質量)×100% 。

1.3 樣品的制備與觀察

取材與固定：水分脅迫30 d后，取各處理幼苗中間部位、大小相近的葉片，沿葉片中部(避開主脈)切取大小1 mm×1 mm的小塊，將樣品放入2.5%的戊二醛溶液中，在4 ℃條件下固定24 h以上。然后用pH為7.2的磷酸緩沖溶液進行漂洗，再用1%的鋨酸溶液對樣品進行后固定，在0～4 ℃條件下固定24 h。

制片與觀察：將樣品取出，用pH為7.2的磷酸緩沖溶液進行漂洗，然后用1%的鋨酸溶液對樣品進行后固定，在0～4 ℃條件下固定24 h。再用pH為7.2的磷酸緩沖溶液漂洗3次，每次25 min，再經過30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水，每級停留30 min，然后用環(huán)氧丙烷置換過渡，Epon812滲透包埋，經超薄切片機切片后，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對染，最后置于透射電鏡在Hu212A透射電鏡下觀測其中柱細胞并拍照(桃葉杜鵑細胞超微結構制片與拍照均在上海交通大學分析測試中心進行)。

2 結果與分析

2.1 菌根侵染率、菌根依賴性和菌根貢獻率

由表1可見，不同ERM菌株接種桃葉杜鵑幼苗，其菌根侵染率差異明顯，其中TY35的侵染率最高為45%，TY29的侵染率為27.5%，未接種的CK處理幼苗根系侵染率為0，極顯著低于接種處理幼苗根系的侵染率。接種苗的菌根依賴性均大于100%，TY35達到147.89%；接種幼苗的菌根貢獻率為13.65%～32.38%。

表1 不同菌株接種桃葉杜鵑幼苗的菌根侵染率 %

注：表中數為“平均值±標準差”；同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2 正常水分條件下的葉片超微結構

正常水分條件下，對照處理與接菌處理的葉肉細胞無結構差異，細胞呈橢圓形或長橢圓形，細胞質壁結合較緊密，細胞膜平滑，清晰可見，內含葉綠體較多，且多呈梭形分布在細胞的邊緣，緊貼著細胞壁，內部結構清晰、完整，類囊體豐富，片層結構發(fā)達，且排列整齊，葉綠體結構上還分布著大小不一的白色淀粉粒以及嗜鋨顆粒。線粒體多呈較規(guī)則的圓形分布在細胞周圍，結構完整，外膜清晰可見，內部電子密度較高，內嵴較豐富(圖1)。

2.3 輕度脅迫條件下的葉片超微結構

輕度脅迫下，各處理苗的葉肉細胞產生了不同的變化，與正常水分相比，CK處理植株的葉肉細胞細胞壁有增厚現象，細胞膜變得模糊、扭曲，細胞質凝聚成許多纖維狀顆粒體，均勻散布在細胞內，葉綠體及各細胞器開始向細胞中央移動，不再貼壁分布(圖2，d1)，葉綠體數量明顯減少，發(fā)生腫脹變形，向內皺縮，類囊體片層開始膨脹(圖2，d2)，淀粉邊緣糊化，少數發(fā)生降解，嗜鋨顆粒數量開始增多。線粒體體積增大，外膜輪廓變得模糊，細胞著色較淺，內部嵴的數量變少(圖2，d3)。TY29處理植株的葉肉細胞細胞膜結構基本完整(圖2，e1)，部分葉綠體發(fā)生變形，類囊體片層結構膨脹，嗜鋨顆粒數量開始增多(圖2，e2)，線粒體數量開始增多，外膜結構清晰，內部變化并不明顯(圖2，e3)。TY35處理植株的變化如圖所示，細胞壁稍有增厚，膜結構清晰，細胞質壁貼合緊密，細胞質也凝聚成許多纖維狀顆粒體(圖2，f1)，葉綠體變化較小，僅少數葉綠體發(fā)生腫脹，嗜鋨顆粒變化不明顯(圖2，f2)。

a1～a3分別為CK處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；b4～b6分別為TY29處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；c7～c9分別為TY35處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體。

圖1正常水分條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細胞超微結構

2.4 中度脅迫條件下的葉片超微結構

隨著脅迫加劇，各處理苗的葉肉細胞形態(tài)進一步發(fā)生改變，CK處理植株的細胞形態(tài)變化最為明顯，葉肉細胞因失水嚴重變形，扭曲，細胞內出現許多深色物質凝聚在細胞邊緣(圖3，g1)，葉綠體進一步腫脹，葉綠體膜系統(tǒng)受到破壞，外膜消失，片層結構模糊不清，有的基粒片層膨脹、溶解或空泡化，類囊體發(fā)生斷裂，多數淀粉粒降解，嗜鋨顆粒增多且有大的嗜鋨顆粒出現(圖3，g2)。線粒體的外膜破裂，嵴消失，內部結構模糊(圖3，g3)。TY29處理植株的葉肉細胞發(fā)生質壁分離現象，外部細胞壁出現破損，細胞膜變得模糊，各細胞器之間界限模糊(圖3，h1)，葉綠體外被膜局部破裂，有部分內含物外流，基粒和基質類囊體膜結構模糊，排列紊亂，嗜鋨顆粒增多(圖3，h2)。線粒體外膜輪廓變得模糊，細胞著色較淺，內部嵴減少(圖3，h3)。中度脅迫下，TY35處理植株的葉肉細胞整體結構未受到破壞，細胞膜基本完整，細胞內有大量纖維狀顆粒物質產生(圖3，i1)，葉綠體腫脹明顯，體積變大或近球形，與細胞壁發(fā)生分離，類囊體空腔膨大，基粒片層排列散亂，有較多嗜鋨顆粒出現(圖3，i2)。線粒體外膜結構清晰，內部嵴減少(圖3，i3)。

d1～d3為CK處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；e1～e3為TY29處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；f1～f3為TY35處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體。

圖2輕度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細胞超微結構

g1～g3為CK處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；h1～h3為TY29處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；i1～i3為TY35處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體。

圖3中度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細胞超微結構

2.5 重度脅迫條件下的葉片超微結構

重度干旱脅迫下，各處理苗的葉肉細胞均出現一定的空泡化，以CK處理植株的最為嚴重，大部分細胞器發(fā)生降解，細胞呈不規(guī)則狀(圖4，j1)，僅有少數葉綠體分布，有的葉綠體已經發(fā)生降解，只殘存零碎的類囊體片段或降解物，嗜鋨顆粒減少(圖4，j2)。線粒體內含物流出，部分降解(圖4，j3)。TY29處理植株的葉肉細胞也呈不規(guī)則狀，但細胞內仍有一定數量的葉綠體分布(圖4，k1)，葉綠體外膜消失，形狀扭曲變形，內部結構模糊，細胞內淀粉粒數量較多，但邊緣逐漸糊化(圖4，k2)，線粒體發(fā)生膨脹變形，外膜結構已消失，內部嵴減少且結構模糊不清(圖4，k3)。相較之下，TY35處理植株的葉肉細胞仍然較為完整，外部沒有發(fā)生明顯變形，膜結構受損，殘存有細胞器降解之后的殘骸(圖4，l1)，葉綠體明顯腫脹、形態(tài)不規(guī)則，類囊體片層排列紊亂，但仍有較多嗜鋨顆粒分布(圖4，l1)。線粒體外膜輪廓變得模糊，細胞著色較淺，內部嵴發(fā)生斷裂(圖4，l1)。

j1～j3為CK處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；k1～k3為TY29處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體；l1～l3為TY35處理植株的葉肉細胞、葉綠體、線粒體。

圖4重度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細胞超微結構

3 討論

在水分虧缺條件下，菌根植物能從土壤中吸收更多的水，使菌根植物受到較少的脅迫，比非菌根植物更耐旱，在逆境來臨時可提高植株對逆境環(huán)境的抵抗能力[7-8]。植物的葉片對環(huán)境的反應最為敏感，環(huán)境的改變容易改變它的形態(tài)結構，植物受到干旱脅迫時，植物細胞中的葉綠體和線粒體是對干旱脅迫比較敏感，所負擔的生理功能較為重要的兩個細胞器，在逆境脅迫下，它們的正常結構及功能的維持對植物抵抗逆境能力的大小起著至關重要的作用[9]。本試驗中，在正常水分條件下，各處理幼苗的細胞形態(tài)結構相同，細胞器也無明顯差異。在輕度脅迫下，CK苗的葉綠體發(fā)生腫脹變形，向內皺縮，類囊體片層開始紊亂，TY29的葉綠體膨脹變圓，而TY35的變化相對較小，表明接種ERM的桃葉杜鵑葉綠體對水分脅迫具有一定的耐受性，葉綠體出現腫脹縮短、體積變大等現象可能是為了減少光線的直接穿透量和受光面積，避免高溫缺水的灼傷，這是葉綠體對逆境脅迫的生理適應性反應[10]。隨著脅迫程度加重，CK葉肉細胞進一步受損，葉綠體解體并出現空泡化，菌根苗的葉綠體膨脹變形，片層結構斷裂，但其受損程度輕于對照。莫言玲[11]對西瓜的研究也有相同的結果，干旱處理下，菌根西瓜葉片的葉綠體超微結構比非菌根植株葉片的排列更整齊、更有序，非菌根植株葉綠體的損傷也更為明顯。輕度脅迫時，線粒體的變化并不明顯，隨著脅迫加劇，葉肉細胞和根系細胞內的線粒體都表現為數量的增加，嵴變少，外膜結構遭到破壞，嚴重脅迫時線粒體降解并空泡化，但不同菌株處理之間傷害表現具有差異性，CK線粒體的損傷程度均大于菌根苗，在水分脅迫下也較早發(fā)生降解，干旱脅迫后線粒體數目增多，可能是對單位線粒體活性降低的補償，從而保證脅迫過程中能量的供應[12]。在逆境脅迫下，線粒體的結構較葉綠體穩(wěn)定，且受損傷晚于葉綠體[13]，這與徐萍等[14]對銀沙槐幼苗，任麗花等對圓葉決明的研究結果相似[15]。

4 結論

干旱脅迫對植物細胞結構的損傷影響是一個漸進的過程，隨著脅迫程度的加強，細胞失水加劇，細胞超微結構的變化也會愈加明顯，干旱脅迫引起細胞結構的破壞，是植物受到傷害的共同特征，其破壞程度取決于植物的抗旱性強弱[16]。 在不同水分條件下，桃葉杜鵑幼苗接種菌根真菌后，葉肉細胞的結構要比不接菌更加完整，干旱脅迫顯著影響桃葉杜鵑幼苗的葉片細胞超微結構。隨著脅迫加劇，幼苗的細胞結構損傷不斷加重，接種不同的ERM對桃葉杜鵑幼苗抗旱性影響不同，接種TY35的菌根幼苗受旱害程度要小于接種TY29的菌株幼苗，但CK苗葉肉細胞的細胞器的受損程度均較菌根苗嚴重，即接種ERM真菌在干旱脅迫下能有效的保護桃葉杜鵑的葉肉細胞結構。

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EffectsofEricoidMycorrhizaFungionRhododendronannaeSeedlingsLeafUltrastructureunderDroughtStress

Xiong Xianrong, Ou Jing, Long Haiyan, Ouyang Jiahui, Xiong Dan

(Guizhou University, Guiyang 50025, P. R. China)Journal of Northeast Forestry University，2017,45(12)：38-43.

Rhododendronannae; ERM; Drought stress; Ultra-structure

1)國家自然科學基金項目(31560223、31460136)；貴州省科技計劃項目(黔科合支撐[2016]2522號)；貴州大學研究生創(chuàng)新基金(研農2017010)。

熊賢榮，女，1992年2月生，貴州大學林學院，碩士研究生。E-mail:907188554@qq.com。

歐靜，貴州大學林學院，教授。E-mail:coloroj@126.com。

2017年6月1日。

潘 華。

S688.9

An experiment was conducted to study the effects of Ericoid Mycorrhiza Fungi on leaf ultrastructure of 1-a seedlings ofRhododendronannaeunder water stress by soil culture experiment. Under drought stress in the greenhouse, the effects on root cells ultrastructures ofR.annaemycorrhizal seedlings were studied. Under normal water condition, the ultrastructure of mesophyll cells was complete. All cell chloroplasts and mitochondria damage were increased gradually, but under the same water stress, inoculated seedlings of cell organelles such as mitochondria and chloroplasts were more stable than control, and TY35 was more apparent in the role of the mesophylls.