，,3，,3， ，

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院；2.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心；3.活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

·藥學(xué)·

牛蒡低聚果糖的提取條件及其穩(wěn)定性研究

袁平川1,2，陳靠山1,2,3，柳春燕1,2,3，房芳1,2，王顏天池1,2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院；2.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心；3.活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

目的：研究牛蒡低聚果糖的最佳提取條件及其穩(wěn)定性。方法通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)對牛蒡低聚果糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，采用蒽酮法測定其在不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果牛蒡低聚果糖最佳提取條件為固液比1∶25、提取溫度80℃、提取時(shí)間90 min，在此條件下，牛蒡低聚果糖得率為67.54%。牛蒡低聚果糖熱穩(wěn)定性及光照條件下穩(wěn)定性較好，易被氧化，在pH>8或pH<4及含有Cu2+、Fe3+溶液中的穩(wěn)定性較差。結(jié)論牛蒡低聚果糖在存儲過程中應(yīng)避免與空氣及鐵銅制品直接接觸，提取時(shí)溫度應(yīng)低于90℃，且溶液無強(qiáng)酸堿性。

牛蒡低聚果糖；提??；穩(wěn)定性

牛蒡(ArctiumlappaL.)又名“大力子”、“白肌人參”、“東洋人參”等，菊科牛蒡?qū)僦备刀晟笮筒荼局参?，其根鮮嫩多汁、營養(yǎng)豐富，食之有香甜味，具有較高的藥用價(jià)值[1-2]。牛蒡低聚果糖是從牛蒡根中提取的一種水溶性菊糖型低聚果糖，分子質(zhì)量為2134 u，是由12個(gè)呋喃果糖以β(2→1)糖苷鍵依次相連，末端1個(gè)吡喃葡萄糖以α(2→1)糖苷鍵連接在果糖上的線性直鏈結(jié)構(gòu)[3-4]。我國牛蒡資源豐富，牛蒡根中菊糖含量較高，從中提取的牛蒡低聚果糖具有增強(qiáng)免疫、抗癌、抗衰老、降低血糖血脂等多種生物活性[5-11]，有著廣闊的開發(fā)及應(yīng)用前景。目前對于牛蒡低聚果糖的提取工藝眾說紛紜，對其穩(wěn)定性的研究也未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化牛蒡低聚果糖的提取工藝，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行初步的研究，為牛蒡低聚果糖在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮牛蒡根購自于江蘇徐州益順康公司并保存于皖南醫(yī)學(xué)院逸夫科技樓實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑 小型高速粉碎機(jī)WK-2000A(青州市精誠醫(yī)藥醫(yī)藥裝備制造有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070型(金壇市榮華儀器制造有限公司)；離心機(jī)SIGMA 4K15；SHB-Ⅲ S循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-TeK公司)；電子天平FA2004N (上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；艾科浦超純水系統(tǒng)AFZ-1001-U (頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；數(shù)顯控溫水浴鍋GKC4 (上海波洛實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。所用試劑均為分析純，水為去離子水；蒽酮、3,5二硝基水楊酸、標(biāo)準(zhǔn)果糖、NaCl、KCl、AlCl3、FeCl3、CaCl2、CuSO4、MgSO4、ZnSO4、濃H2SO4、H2O2、Na2SO3。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 原料(新鮮牛蒡根)→洗凈、晾干→100℃水熱燙5 min→去皮→切薄片→60℃烘干→粉碎、過40目篩→牛蒡干粉(常溫下保存)

1.3.2 牛蒡低聚果糖的提取 牛蒡低聚果糖為本實(shí)驗(yàn)室提取得到[3-4]。

1.3.3 牛蒡低聚果糖提取條件的優(yōu)化 以同批處理的牛蒡干粉為材料，以水為提取溶劑，考察不同固液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對牛蒡低聚果糖得率的影響。在單因素試驗(yàn)的結(jié)果上進(jìn)行正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝，研究影響因素，確定最佳提取條件。

1.4 牛蒡低聚果糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精確稱取牛蒡低聚果糖干燥成品20 mg，超純水溶解并定容至100 mL，具體實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行適當(dāng)稀釋。蒽酮硫酸法測定牛蒡低聚果糖在不同溫度、光照條件、pH值、氧化劑、還原劑和金屬離子條件下的穩(wěn)定性，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 分析方法

1.5.1 總糖含量測定 采用改良蒽酮硫酸法[12]，以果糖為標(biāo)準(zhǔn)品，糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=4.5257x+0.0101，R2=0.9993。

1.5.2 還原糖含量測定 采用3,5二硝基水楊酸法，以果糖為標(biāo)準(zhǔn)品，糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=1.1334x-0.0217，R2=0.9988。

1.5.3 總糖得率及低聚果糖含量的計(jì)算 總糖得率(%)=樣品中總糖含量/原料質(zhì)量×100%;低聚果糖含量=總糖含量-還原糖含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，以F檢驗(yàn)分析組間顯著性差異，P< 0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡低聚果糖提取條件的優(yōu)化 通過單因素實(shí)驗(yàn)探討了牛蒡低聚果糖提取條件的最佳范圍，選擇固液比、提取溫度及提取時(shí)間為考察因素，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，見表1、2。由表3可知，因素A具有極顯著性差異(P<0.01)，因素B和C都具有顯著性差異(P<0.05)。因此，影響牛蒡低聚果糖提取率的因素依次是：固液比>提取溫度>提取時(shí)間，由表1、2可知最佳提取條件為A3B3C2，即在固液比為1∶25(g/mL)、提取溫度為80℃、提取時(shí)間為90 min條件下，牛蒡低聚果糖提取率為67.54%。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)表

水平因素固液比(m∶V)A提取溫度/℃B提取時(shí)間/minC11∶15606021∶20709031∶2580120

表2 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

序號因素水平A固液比/m∶V(g∶mL)B提取溫度/℃C提取時(shí)間/min總糖提取率/%11(1∶15)1(60)1(60)55.0621(1∶15)2(70)2(90)62.5631(1∶15)3(80)3(120)59.5642(1∶20)1(60)2(90)63.2552(1∶20)2(70)3(120)66.1962(1∶20)3(80)1(60)64.9573(1∶25)1(60)3(120)59.5083(1∶25)2(70)1(60)65.4593(1∶25)3(80)2(90)67.54K1177.18177.81185.46K2194.39194.20193.35K3192.49192.05185.25k159.0659.2761.82k264.8064.7364.45k364.1664.0261.75R5.745.462.70

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

因素偏差平方和自由度均方FPA59.354229.667106.5860.009B52.892226.44694.9820.010C14.21227.10625.5210.038

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.1 溫度條件 取2 mL牛蒡低聚果糖溶液8份于試管中，封口避光條件下于20、30、40、50、60、70、80、90℃ 下恒溫水浴1 h后，分別測定溶液吸光度。由圖1可知，牛蒡低聚果糖在溫度20～80℃范圍內(nèi)吸光值變化較小，80℃后吸光度值明顯增大，可能是由于低聚果糖在高溫條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。由此可知牛蒡低聚果糖在20～80℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好。

2.2.2 光照條件 取5 mL牛蒡低聚果糖溶液14份于離心管中，封口并于室溫條件下分別光照0、12、24、36、48、60、72 h，對照組避光放置，分別測定溶液吸光度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光照對牛蒡低聚果糖穩(wěn)定性基本無影響，由此可知牛蒡低聚果糖在光照條件下能保持較好的穩(wěn)定性。

2.2.3 pH條件 取5 mL牛蒡低聚果糖溶液6份于試管中，室溫下用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH至2、4、6、8、10、12，搖勻避光靜置3 h后，分別測定溶液吸光度。由圖2可知，牛蒡低聚果糖在pH 4～8之間，吸光度值變化較小，糖溶液穩(wěn)定性較好，而在pH>8或pH<4的溶液體系中吸光度值明顯增大，糖液穩(wěn)定性較差，可能在強(qiáng)酸堿性條件下，糖結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致吸光度值升高。

圖1 溫度對牛蒡低聚果糖穩(wěn)定性的影響

圖2 pH對牛蒡低聚果糖穩(wěn)定性的影響

2.2.4 氧化劑、還原劑條件 取1 mL牛蒡低聚果糖溶液12份，分別加入濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L的 H2O2和濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L的Na2SO3溶液各4 mL，搖勻避光靜置3 h后，分別測定溶液吸光度。由圖3可知，牛蒡低聚果糖水溶液的吸光度隨Na2SO3濃度增大未產(chǎn)生明顯改變，而隨H2O2濃度增大而增大。或由于在氧化劑的作用下，低聚果糖產(chǎn)生較多醛類物質(zhì)，在結(jié)合蒽酮后顏色加深。

圖3 氧化還原劑對牛蒡低聚果糖穩(wěn)定的影響

2.2.5 金屬離子條件 取1 mL牛蒡低聚果糖溶液8份，分別加入離子濃度為0.05 mol/L 的NaCl、KCl、AlCl3、FeCl3、CaCl2、CuSO4、MgSO4、ZnSO4溶液各4 mL，搖勻避光靜置3 h，分別于0、1、2、3 h測定溶液吸光度。由圖4可知，牛蒡低聚果糖在多數(shù)金屬離子溶液體系中穩(wěn)定性較好，但在Cu2+、Fe3+溶液中穩(wěn)定性較差?；蛴捎贑u2+、Fe3+與低聚果糖發(fā)生某些化學(xué)反應(yīng)，如氧化、絡(luò)合等，導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)改變。

圖4 金屬離子對牛蒡低聚果糖穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)分析后，選取固液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合方差分析得到影響因素為：固液比>提取溫度>提取時(shí)間，最佳提取條件為，固液比1∶25、提取溫度80℃、提取時(shí)間90 min，此條件下牛蒡低聚果糖提取率為67.54%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明：牛蒡低聚果糖在20～80℃條件下熱穩(wěn)定性較好，不受光照影響，易被氧化，不易被還原，在pH 4～8、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+溶液中穩(wěn)定性較好，在pH>8或pH<4及體系含有Cu2+、Fe3+情況下穩(wěn)定性較差。因此牛蒡低聚果糖常溫存儲過程中需隔絕氧氣或加入抗氧化劑，避免與鐵、銅制品直接接觸，在提取過程中應(yīng)于90℃以下提取，避免在強(qiáng)酸堿性的溶液中提取。

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Ontheextractionprocessandstabilityofburdockoligosaccharide

YUANPingchuan,CHENKaoshan,LIUChunyan,FANGFang,WANGYanTianchi

Department of Pharmacy，Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To investigate the optimal conditions for extracting the oligosaccharide from burdock and stability of the extracts.Methods:Single-factor experiment and orthogonal test were used to optimize the extraction conditions for burdock oligosaccharide,and the stability of the extracts was determined under diverse conditions using anthrone method.Results:The optimal conditions for extracting the oligosaccharide from burdock were:solid/liquid ratio 1∶25,temperature at 80℃,extraction time for 90 min. This condition yielded burdock oligosaccharide by 67.54%. The stability for burdock oligosaccharide was better when heated or lighted,yet the extract was susceptible to oxidation,and the stability appeared poorer when stored in solution with pH>8 or pH<4 or containing Cu2+or Fe3+.Conclusion:Burdock oligosaccharide should be stored at room temperature and isolated from oxygen without antioxidant supplement,and be free of direct contact with iron or copper during the extraction process. The extraction process must be under 90℃,and kept from solution with strong acidity and alkaline.

burdock oligosaccharide;extracting;stability

1002-0217(2017)05-0424-04

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MH197)；安徽高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2015A199)；蕪湖市科技計(jì)劃項(xiàng)目( 2012jc14)

2017-04-05

袁平川(1992-)，男，2015級碩士研究生，(電話)18355336398，(電子信箱)2455474850@qq.com;陳靠山(1962-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，(電子信箱)ksc313@126.com,通信作者。

R 285.5

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.005