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(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室;2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

亞急性酒精中毒戒斷對大鼠痛覺時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系的影響

葛微微1,2，姚俊1,2，蔡婷婷1，2，周婷婷1,2，張艷1，汪萌芽1

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室;2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察亞急性酒精中毒戒斷對大鼠光輻射熱甩尾反射時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(TDRR)的影響。方法取雄性SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(NS，n=9)和亞急性酒精中毒組(SA，n=6)。SA組大鼠給予56%乙醇灌胃10 d(15 mL/kg，qd)造模，NS組大鼠給予等容量的生理鹽水。停止酒精灌胃后6 h觀察戒斷癥狀，并在戒斷1 d、3 d、7 d、10 d、14 d，應(yīng)用移動光輻射熱甩尾反射法重復(fù)檢測大鼠光輻射熱甩尾反射的潛伏期(TFL)和光照強(qiáng)度(Focus值)之間的TRDD。結(jié)果①與NS組相比，SA組的體質(zhì)量增長在造模期間無明顯差異,但戒斷期間明顯受抑(P<0.05)。②SA組在戒斷1 d時(shí)Focus值為23的TFL比NS組縮短(P<0.05)，且2組大鼠戒斷后TFL的TDRR重復(fù)測量雙因素方差分析顯示，光照強(qiáng)度因素、組間因素以及光照強(qiáng)度因素與組間因素的交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。③對戒斷1 d和14 d的2組TDRR進(jìn)行雙曲線型四參數(shù)模型Y=cs+1/(x-a)s+b的非線性擬合分析表明，SA組在戒斷1 d的參數(shù)c減小，3～14 d逐漸恢復(fù)。結(jié)論亞急性酒精中毒戒斷第1天出現(xiàn)痛覺敏化，隨后逐漸恢復(fù)。

亞急性酒精中毒；酒精戒斷；痛覺；時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系

亞急性酒精中毒的病程介于急、慢性酒精中毒之間，是慢性酒精中毒的早期損傷，主要表現(xiàn)為肝功能損傷、營養(yǎng)素代謝紊亂和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等方面[1]。大量研究結(jié)果顯示，長期飲酒不僅對學(xué)習(xí)記憶造成損害[2-4]，也可影響痛覺，如攝入酒精可以提高痛閾[5]，戒斷后可誘發(fā)痛覺過敏[6]，且創(chuàng)傷、壓力、傷害等可加強(qiáng)酒精成癮戒斷后誘發(fā)的痛覺過敏和痛情緒[7]。有關(guān)痛覺及其敏化的特性，已有大鼠光輻射熱甩尾反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(timed dose-response relationship，TDRR)分析報(bào)道[8-10]，但亞急性酒精中毒戒斷對大鼠痛覺及其TDRR的影響尚未見報(bào)道。本文旨在通過建立亞急性酒精中毒模型，了解和分析亞急性酒精中毒戒斷影響大鼠痛覺及其TDRR的特性，為進(jìn)一步研究亞急性酒精中毒戒斷影響大鼠痛覺的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 取清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK(浙)2014-0001，體質(zhì)量180～200 g。飼養(yǎng)的明/暗周期為12 h/12 h，自由飲食和飲水。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組，生理鹽水組(saline group，NS組)9只，亞急性酒精中毒組(subacute alcoholism group，SA組)6只。

1.2 儀器與試劑 光輻射熱測痛儀(LE 7106 Light Beam Analgesy-Meter,Panlab,USA)。無水乙醇(分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠)、生理鹽水( 揚(yáng)州中寶制藥有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亞急性酒精中毒模型的建立 參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[11-12]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予SA組大鼠56%乙醇灌胃10 d，劑量為15 mL/kg(qd)，NS組大鼠給予等容量的生理鹽水。

1.3.2 亞急性酒精中毒模型戒斷的鑒定 每天觀察和記錄大鼠飲食、飲水、體質(zhì)量、睡眠和活動等。停止灌胃酒精后，觀察到大鼠出現(xiàn)打噴嚏、理毛增加、極易激怒、尾僵直、異常姿勢等戒斷癥狀，表明造模和戒斷成功。

1.3.3 光輻射熱甩尾反射檢測 將大鼠固定，其尾部暴露并自然下垂，待動物安靜20 min后，使用光輻射熱測痛儀檢測。照射相當(dāng)于尾部中、后三分之一交界處的皮膚，照射啟動時(shí)開始計(jì)時(shí)，當(dāng)動物尾部出現(xiàn)明顯逃避時(shí)所測得的時(shí)間間隔即為甩尾反射潛伏期(tail-flick latency，TFL)。除在造模前、造模1周檢測Focus =23的TFL外，還在酒精戒斷1 d、3 d、7 d、10 d、14 d進(jìn)行TFL的TDRR檢測(Focus =10、15、23、34、51、76)。

2 結(jié)果

2.1 亞急性酒精中毒戒斷對體質(zhì)量的影響 基礎(chǔ)值和灌胃1周的NS組大鼠與SA組大鼠的體質(zhì)量相似(基礎(chǔ)值：t=1.584，灌胃1周：t=1.992；P均>0.05)，而亞急性酒精中毒戒斷期間，SA組大鼠的體質(zhì)量低于NS組大鼠(戒斷1 d：t=6.045，P<0.01；戒斷3 d：t=3.282，P<0.01；戒斷7 d：t=2.616，P<0.05；戒斷10 d：t=4.696，P<0.01；戒斷14 d：t=4.261，P<0.01)，見圖1。

圖1 亞急性酒精中毒戒斷對體質(zhì)量的影響

2.2 亞急性酒精中毒戒斷對TFL的影響 在進(jìn)行亞急性酒精中毒和戒斷過程中，檢測光照強(qiáng)度Focus值為23時(shí)的TFL見圖2。結(jié)果顯示，SA組在戒斷1天時(shí)TFL不僅較NS組縮短(t=2.748，P<0.05)，且比造模前、造模1周亦縮短(基礎(chǔ)值：t=3.481，P<0.05；灌胃1周：t=2.648，P<0.05)，提示戒斷時(shí)痛覺閾值下降，有痛覺敏化。但在戒斷3～14 d逐漸恢復(fù)(戒斷3 d：t=2.823，P<0.05；戒斷7 d：t=4.956，P<0.01；戒斷10 d：t=2.903，P<0.05；戒斷14 d：t=6.554，P<0.01)。

圖2 光照強(qiáng)度Focus值為23時(shí)的甩尾反射潛伏期比較

2.3 亞急性酒精中毒戒斷對痛覺TDRR的影響 在戒斷期間，NS組大鼠的TFL沒有明顯改變，但SA組大鼠的TFL在戒斷第1天縮短，提示大鼠痛覺敏化，后大鼠TFL逐漸恢復(fù)(圖3)。經(jīng)重復(fù)測量的雙因素方差分析，光照強(qiáng)度因素(F=22.090)、組間因素(F=11.602)以及光照強(qiáng)度因素和組間因素的交互作用(F=8.628)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。光照強(qiáng)度間差異提示TFL與光照強(qiáng)度間存在TDRR，而組間差異及其與光照強(qiáng)度因素的交互作用則顯示了SA組與NS組的TDRR不同(圖3)，特別是戒斷1 d時(shí)SA組的TDRR曲線較NS組左移，提示了痛覺的敏化，而戒斷14 d時(shí)兩組TDRR曲線的幾乎重合，提示了痛覺敏感性的恢復(fù)(圖4)。

圖3 戒斷期間NS組(A)和SA組(B)大鼠光輻射熱甩尾反射潛伏期的TDRR比較

2.4 痛覺TDRR的曲線擬合分析 進(jìn)一步對戒斷1 d和14 d的NS組和SA組大鼠TFL的TDRR數(shù)據(jù)應(yīng)用雙曲線型四參數(shù)模型Y=cs+1/(x-a)s+b[9]進(jìn)行非線性擬合分析(圖4)，擬合結(jié)果分別為，SA組戒斷1 d：c=8.156，s=1.147，a=5.649，b=0.9264，R2=0.8461;相應(yīng)的NS組：c=1352，s=96.98，a=-1403，b=2.217，R2=0.9011。SA組戒斷14 d：c= 1260，s=98.15，a=-1306，b=2.289，R2=0.9541;相應(yīng)的NS組：c=462.8，s=45.02，a=488.0，b=2.809，R2=0.9104。提示其屬于雙曲線型的TDRR，與NS組相比，亞急性酒精中毒戒斷1 d時(shí)SA組TDRR曲線的曲度參數(shù)c減小而曲線左移，呈現(xiàn)痛覺閾值降低而敏化，戒斷14 d時(shí)已恢復(fù)。

圖4 戒斷1 d和14 d兩組大鼠光輻射熱甩尾反射潛伏期的TDRR分析

3 討論

本研究采用56%酒精灌胃10 d的方法建立亞急性酒精中毒模型。停止酒精灌胃后(戒斷)，觀察大鼠出現(xiàn)打噴嚏、理毛增加、極易激怒、尾僵直、異常姿勢等戒斷癥狀，顯示造模成功。

在灌胃期間，SA組與NS組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明56%酒精灌胃沒有明顯影響大鼠體質(zhì)量增長；而停止酒精灌胃后，SA組與NS組大鼠體質(zhì)量有明顯差異,表明酒精戒斷對大鼠體質(zhì)量增長有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，亞急性酒精中毒大鼠戒斷后出現(xiàn)煩躁不安等戒斷癥狀，這與相關(guān)報(bào)道[13-14]的結(jié)果相一致。本研究表明，亞急性酒精中毒大鼠在戒斷1 d時(shí)不僅單一光照強(qiáng)度Focus值為23時(shí)的TFL出現(xiàn)縮短，而且TDRR曲線也出現(xiàn)左移，提示痛覺敏化；而戒斷3～14 d均逐漸恢復(fù)。谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)是腦內(nèi)主要的興奮性氨基酸，其參與突觸興奮傳遞、學(xué)習(xí)記憶形成，與多種神經(jīng)變性疾病有關(guān)[15]。興奮性氨基酸儲存于突觸前末梢內(nèi)，以Ca2+依賴方式釋放作用于突觸后膜興奮性氨基酸受體而發(fā)揮其作用[16]。有研究表明，長期飲酒使興奮性氨基酸受體(主要是NMDA受體)敏感性及數(shù)目增加[17-18]。NMDA受體被激活后，其通道開放，并通過一氧化氮合酶(NOS)促進(jìn)大量NO產(chǎn)生，NO又促進(jìn)NMDA的活性，形成正反饋，從而提高神經(jīng)元的興奮性，使疼痛中樞敏感化，傷害性刺激信號傳入增強(qiáng)，導(dǎo)致痛覺過敏[19]。由此可見，酒精作用本身可抑制谷氨酸釋放和受體功能，進(jìn)而導(dǎo)致受體代償性上調(diào)，一旦突然戒斷酒精，酒精的抑制作用減弱而谷氨酸釋放和受體敏感性升高，進(jìn)而導(dǎo)致痛覺過敏。至于痛覺TDRR分析，表明了亞急性酒精中毒戒斷1 d時(shí)SA組痛覺敏化的特性，即敏化不是TDRR曲線的平移，而是其曲度參數(shù)c[9]減小而呈現(xiàn)曲線左移；同時(shí)還提示，這種敏化與光照強(qiáng)度有關(guān)，即傷害性刺激過弱或過強(qiáng)均不呈現(xiàn)敏化，可能提示了受體激活的閾刺激或飽和刺激特性，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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Withdrawaleffectsofsubacutealcoholismontimeddose-responserelationshipforpaininrats

GEWeiwei，YAOJun，CAITingting，ZHOUTingting，ZHANGYan，WANGMengya

Cell Electrophysiology Laboratory,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To observe the withdrawal effects of subacute alcoholism on timed dose-response relationship (TDRR) for tail-flick response induced by light radiant heat in rats.Methods:Fifteen male SD rats were randomized into normal saline administration group (NS,n=9) and subacute alcoholism group (SA,n=6). Rats in SA group were intragastrically given 56% alcohol solution (15 mL/kg)(qd) for 10 days,and those in NS group were administrated by saline with corresponding content. Withdrawal symptoms were observed in rats at 6h after cessation. The tail-flick latency (TFL) evoked by diverse light intensity (Focus=10,15,23,34,51,76) was measured with light beam analgesy-meter at moved points of tail on the 1st,3rd,7th,10th and 14th day after withdrawal,and then the TDRR was analyzed between the light intensity and TFL.Results:①Body weight increase remained no notable difference between rats in NS and SA group,yet rats in SA group were less increased after withdrawal (P<0.05);②TFLs at Focus=23 and 1-day withdrawal were shorter for rats in SA group than NS group (P<0.05). Two-way ANOVA analysis of TFL data for rats in two groups showed that factors of light-intensity and group, as well as interaction between group and light-intensity were all significant (P<0.01);③The TDRR data of TFLs at 1-day and 14-day withdrawal for rats in 2 groups were nonlinearly fitted to the hyperbolic 4-parameter model Y=cs+1/(x-a)s+b,and the parameters showed that parameter c in TDRR of 1-day withdrawal in SA group was decreased and then recovered during 3- to 14-day withdrawal.Conclusion:The results suggest that withdrawal of subacute alcoholism may dramatically induce pain sensitization in rats,and the pain response tends to recover in 3 to 14 days following withdrawal.

subacute alcoholism;alcohol withdrawal;pain;timed dose-response relationship

1002-0217(2017)05-0417-04

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 (AH201410368095)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31271155、31300922)

2017-04-13

葛微微(1994-)，女，2012級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，(電話)15755370930，(電子信箱)1790183840@qq.com；汪萌芽，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通信作者。

R 595.6;R 33-33

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.003