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(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 心功能科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 a.生理學(xué)教研室;b.病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

番茄紅素對(duì)膿毒血癥大鼠心肌損傷的影響

楊濤1，姜玉新2a，李偉2b，王國(guó)光2b

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 心功能科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 a.生理學(xué)教研室;b.病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察番茄紅素對(duì)膿毒血癥大鼠心肌損傷的影響。方法雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NOR)、膿毒血癥組(SEP)及番茄紅素處理組(LYC)。大鼠通過腹腔注射內(nèi)毒素(20 mg/kg)制備膿毒血癥模型，番茄紅素處理組大鼠在以番茄紅素預(yù)處理2 h后腹腔注射內(nèi)毒素，6 h后，收集血樣品及心臟。檢測(cè)血清炎癥細(xì)胞因子水平、抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量；觀察心肌組織學(xué)變化；檢測(cè)心肌組織炎癥調(diào)節(jié)蛋白磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、環(huán)氧酶-2(COX-2)的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，膿毒血癥組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)及MDA含量升高，超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，心肌組織p-NF-κB和COX-2水平升高；番茄紅素處理明顯降低血清TNF-α和IL-6及MDA含量，提高SOD活性，降低心肌組織p-NF-κB和COX-2表達(dá)。形態(tài)觀察可見膿毒血癥組大鼠心肌纖維損傷、排列疏松，番茄紅素處理減輕了心肌纖維損傷。結(jié)論番茄紅素預(yù)處理可減輕膿毒血癥大鼠的心肌損傷，其機(jī)制可能通過下調(diào)炎癥信號(hào)NF-κB/COX-2實(shí)現(xiàn)。

番茄紅素；膿毒血癥；心肌損傷

膿毒血癥是由感染引起的炎癥失調(diào)而導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是臨床高致死率的重要原因[1]。研究認(rèn)為，炎癥因子過度釋放，在膿毒血癥器官損傷中起著重要作用，并影響預(yù)后效果[2-4]。心肌是膿毒血癥損傷的重要器官，是導(dǎo)致膿毒血病人死亡的重要原因[5]。番茄紅素(lycopene)是一種不含氧的類胡蘿卜素，廣泛存在于番茄等紅色水果中[6]。番茄紅素有許多重要的生物學(xué)功能，研究表明，番茄紅素有抗腫瘤及抗氧化等作用[7-9]，并且其血清濃度與急性心肌梗死及心源性猝死相關(guān)[10-11]。本研究旨在觀察番茄紅素對(duì)膿毒血癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 試劑與器材 番茄紅素購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(NO. 502-65-8)，內(nèi)毒素(Escherichia coli 0111：B4)為Sigma公司產(chǎn)品，SOD和MDA檢測(cè)試劑盒為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；TNF-α、IL-6特異度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自合肥博美生物工程有限公司；β-actin、磷酸化核因子κB(phosphorylation of nuclear factor kappa B，p-NF-κB)、環(huán)氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)及核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)多克隆抗體購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1．2 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 雄性SD大鼠(體質(zhì)量260～300 g)購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)(許可證號(hào)：SCKK2009-0001)。在1周的自由飲水、進(jìn)食適應(yīng)后，大鼠被隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NOR)、膿毒血癥組(SEP)及番茄紅素處理組(LYC)，每組10只。

1．2．2 動(dòng)物模型復(fù)制 各組大鼠分別以腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，番茄紅素處理組大鼠通過尾靜脈注射番茄紅素(50 mg/kg)，正常對(duì)照及膿毒血癥組大鼠尾靜脈注射等體積溶劑。2 h后，番茄紅素處理組及膿毒血癥組大鼠通過腹腔注射內(nèi)毒素(20 mg/kg)，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水。注射6 h后，動(dòng)脈插管收集血樣品，并取心臟分別置于10%甲醛，-80℃保存。

1．2．3 SOD活性及MDA含量檢測(cè) 血樣品離心，取上清液檢測(cè)血清SOD活性及MDA含量。黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清MDA。

1．2．4 炎性因子檢測(cè) 血清TNF-α、IL-6分別以TNF-α、IL-6特異ELISA試劑盒檢測(cè)。操作按產(chǎn)品說明書步驟進(jìn)行。

1．2．5 組織觀察 取甲醛中固定的心肌，以石蠟包埋，制作5 μm切片，以蘇木素-伊紅(H-E)染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1．2．6 Western blot 取-80℃保存的心肌置于有預(yù)冷組織裂解液的勻漿器中勻漿、裂解，轉(zhuǎn)移至EP管，4℃下，以11 500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min。將含等量蛋白量的上清液稀釋至等體積，以10% SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離后，蛋白電泳轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。膜以5%的脫脂奶粉液封閉，加β-actin、p-NF-κB、COX-2及NF-κB抗體，4℃下雜交過夜，膜以TBS-T清洗后，與Ⅱ抗孵育雜交2 h，洗膜，以DAB顯色。

2 結(jié)果

2．1 SOD活性及MDA的變化 3組大鼠血清SOD活性比較(F=47.03，P<0.01)及MDA含量比較(F=66.98，P<0.01)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膿毒血癥組大鼠血清SOD活性較正常對(duì)照組降低[(183.41±13.60)U/mLvs.(132.23±10.15)U/mL，P<0.01]，而MDA升高[(4.06±0.63)nmol/mLvs. (10.72± 1.74)nmol/mL，P<0.01](圖1)；番茄紅素處理組較膿毒血癥組SOD活性增強(qiáng)[(132.23±10.15)U/mLvs.(168.06±12.33) U/mL，P<0.01]，而MDA含量降低[(10.72±1.74)nmol/mLvs. (7.16±1.24) nmol/mL，P<0.01](圖1)。

**P<0.01vs. NOR；##P<0.01vs. SEP。

圖1 番茄紅素對(duì)血清SOD活性和MDA含量的影響

2．2 番茄紅素對(duì)炎性因子的影響 由圖2可知，各組大鼠血清炎性因子TNF-α(F=19.53，P<0.01)及IL-6(F=13.63，P<0.01)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較，膿毒血癥組大鼠血清TNF-α和IL-6升高[(190.63±10.84 )ng/Lvs. (231.14±18.48) ng/L，(26.41±2.28) ng/Lvs. (32.91±3.15) ng/L,P<0.01];番茄紅素預(yù)處理較膿毒血癥組血清TNF-α和IL-6水平降低[(231.14±18.48) ng/Lvs. (193.28±13.12) ng/L，(32.91±3.15) ng/Lvs. (27.60±2.45) ng/L,P<0.01]。

**P<0.01vs. NOR；##P<0.01vs. SEP。

圖2 番茄紅素對(duì)血清炎性因子的影響

2．3 組織學(xué)變化 對(duì)照組大鼠心肌排列規(guī)則且緊密；內(nèi)毒素處理使大鼠心肌纖維斷裂而出現(xiàn)空泡化，破壞心肌纖維排列使其疏松，心肌有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；番茄紅素預(yù)處理改善心肌纖維排列，減輕心肌損傷。見圖3。

圖3 心肌形態(tài)學(xué)變化

2．4 番茄紅素對(duì)p-NF-κB和COX-2表達(dá)的影響 各組大鼠心肌p-NF-κB及COX-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，內(nèi)毒素處理明顯提高膿毒血癥組大鼠心肌p-NF-κB、COX-2表達(dá)；番茄紅素預(yù)處理降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)p-NF-κB、COX-2表達(dá)。見圖4。

圖4 番茄紅素對(duì)心肌p-NF-κB和COX-2表達(dá)的影響

3 討論

膿毒血癥是由各種病原菌侵襲入血引起感染并釋放毒素(如內(nèi)毒素)而導(dǎo)致的過度全身炎癥反應(yīng)[12-13]。由于感染使炎性細(xì)胞激活釋放大量的炎癥因子，進(jìn)而使炎癥反應(yīng)瀑布式爆發(fā)，累及全身組織器官，導(dǎo)致組織器官功能受損，心肌損傷而引起心功能障礙是膿毒血癥常見的并發(fā)癥，是膿毒血癥高病死率的重要因素[14]。

內(nèi)毒素在膿毒血癥心肌損傷中起著非常重要的作用[15]。研究表明，感染時(shí)，大量釋放的內(nèi)毒素與膜表面Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放[16]。作為炎癥標(biāo)志物的TNF-α、IL-6及IL-1β是重要的炎性介質(zhì)，在膿毒血癥血清中升高[17]。這些炎性細(xì)胞因子參與膿毒血癥的器官損傷作用，如TNF-α可作用于心肌，使心肌纖維發(fā)生損傷[18]。番茄紅素是抗氧化作用最強(qiáng)的類胡蘿卜素，近年研究顯示，其還可抑制膽固醇的合成及增強(qiáng)機(jī)體免疫力[19-20]。本研究結(jié)果表明，注射內(nèi)毒素大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高，番茄紅素預(yù)處理降低TNF-α、IL-6水平。NF-κB被內(nèi)毒素激活，進(jìn)而激活COX-2，NF-κB/ COX-2信號(hào)通路通過激活炎性細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)炎性介質(zhì)的表達(dá)[16]。番茄紅素預(yù)處理明顯抑制COX-2及NF-κB的激活。結(jié)果提示番茄紅素可能通過抑制NF-κB/COX-2信號(hào)降低炎性細(xì)胞因子釋放而發(fā)揮抗炎作用。

膿毒血癥釋放的內(nèi)毒素增加活性氧及自由基的產(chǎn)生，是膿毒血癥器官損傷的重要環(huán)節(jié)。研究顯示內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)可誘發(fā)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[21]。因此，提高機(jī)體的抗氧化作用，有利于降低炎癥反應(yīng)及減輕組織損傷。作為抗氧化作用最強(qiáng)的類胡蘿卜素，番茄紅素降低血清MDA水平及SOD活性。結(jié)果表明，番茄紅素可降低內(nèi)毒素引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，番茄紅素可減輕膿毒血癥大鼠的心肌損傷，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB/COX-2信號(hào)，降低炎癥反應(yīng)而發(fā)揮作用，詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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Effectsoflycopeneonmyocardialinjuryinratswithsepsis

YANGTao,JIANGYuxin,LIWei,WANGGuoguang

Department of Cardiac Function Test,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the effects of lycopene on myocardial injury in rats with sepsis.Methods:Male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly assigned to three groups:normal control (NOR),sepsis model (SEP),and lycopene treatment (LYC). Rat models of sepsis were induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS,20 mg/Kg). Rats in LYC group were pre-treated with lycopene for 2 h,followed by intraperitoneal use of LPS. Then blood samples and hearts were collected 6 h after LPS treatment. Levels of inflammatory cytokines,including tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6),superoxide dismutase (SOD) activity,and malondialdehyde (MDA) content in serum were determined. Levels of cyclooxygenase-2 (COX-2) and phosphorylation of nuclear factor kappa B (p-NF-κB) in myocardial tissues were measured with Western blot. Myocardial tissues were processed for histological examination.Results:Compared with NOR,serum levels of TNF-α and IL-6,MDA content were significantly increased in SEP,yet SOD activity was decreased. LPS significantly led to increase of p-NF-κB and COX-2 expression in myocardial tissues,whereas lycopene pretreatment resulted in significantly decreased levels of inflammatory cytokines,and malondialdehyde (MDA) content in serum. Expressions of p-NF-κB and COX-2 in myocadial tissues were significantly decreased by lycopene. Morphological analysis indicated that lycopene was capable of alleviating the myocardial injury.Conclusion:Lycopene may protect the rats of sepsis from myocardial injury. The potential mechanisms may be associated with down regulation of the signaling of inflammatory cytokines(NF-κB/COX-2).

lycopene；sepsis；myocardial injury

1002-0217(2017)05-0-0413-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81671586)

2017-02-20

楊 濤(1986-)，男，住院醫(yī)師，(電話)15855995768，(電子信箱)tt520cg@126.com；王國(guó)光，男，教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)guoguangw1226@sina.com，通信作者。

R 285.5;R 459.7

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.002