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免疫組織化學檢測CD3d、CD4、LCK、IL-7R在淚腺良性淋巴上皮病變組織的表達及臨床意義

劉驍王蕾馬建民葛心李靜王霄娜

目的檢測LGBLEL患者病變淚腺標本組織中CD3d、CD4、LCK、IL-7R的表達情況，探討病變組織中CD3d、CD4、LCK、IL-7R的表達與LGBLEL發(fā)病之間的關系。方法采用免疫組織化學方法檢測LGBLEL患者病變淚腺組織中CD3d、CD4、LCK、IL-7R等蛋白的表達情況，并以單純眼眶海綿狀血管瘤患者瘤體組織標本做對照。采用半定量積分法(semi-quantitative immunoreactivity scores，IRS)計算實驗組及對照組標本組織中的陽性表達積分值。結果免疫組織化學檢測結果顯示LGBLEL組CD3d、CD4、LCK、IL-7R蛋白表達均呈陽性；CD3d在淋巴濾泡周圍陽性表達率高達85.5%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率高達51.8%，總體積分值為強陽性(++++)；CD4在淋巴濾泡周圍陽性表達率高平均約54.6%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率高達22.5%，總體積分值為陽性(+++)；LCK在淋巴濾泡周圍陽性表達率高平均約28.9%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率高達9.8%，總體積分值為陽性(++)；IL-7R在淋巴濾泡周圍陽性表達率高平均約9.7%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率平均約4.6%，總體積分值為陽性(+)；CD3d、CD4、LCK、IL-7R在腺上皮腺泡的表達呈現(xiàn)明顯差異，其中CD3d陽性表達率最高，表達約13.5%，并可見CD3d陽性細胞侵入腺泡現(xiàn)象，CD4陽性表達率次之，表達約4.5%，偶見侵入腺泡現(xiàn)象。LCK、IL-7R在腺泡的表達均呈陰性，未見侵入腺泡現(xiàn)象。眼眶海綿狀血管瘤組CD3d、CD4、LCK、IL-7R表達均呈陰性。結論CD3d、CD4、LCK、IL-7R因子在LGBLEL病變組織中的表達異常，CD3d、CD4、LCK、IL-7R因子參與了LGBLEL的發(fā)病過程。

良性淋巴上皮病變；淚腺；發(fā)病機制

淚腺良性淋巴上皮病變(lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion, LGBLEL)是一種以淚腺腫大和眼瞼腫脹為主要臨床表現(xiàn)的較為常見的眼眶疾病[1，2]。該病可以發(fā)生于任何年齡、種族、性別的人群，以中年女性多見[3]。該病可以反復發(fā)作、經久不愈[4]，并有惡變的可能[5，6], 是一種嚴重危害人類健康的眼眶疾病。目前，有關LGBLEL的病因及發(fā)病機制尚不清楚，主要的假說包括上皮-肌上皮島假說、病毒誘導假說、自身免疫假說、激素紊亂假說、蛋白紊亂假說、IgG4浸潤假說等[7]。這些假說雖然可以從不同側面對該病發(fā)病進行解釋，但都各存爭議，有待更深入的研究。近年來，隨著組織胚胎學的深入研究，發(fā)現(xiàn)了多種淋巴管內皮標志物，這些標志物為觀測淋巴管生成開辟了新的途徑。本研究采用免疫組織化學技術檢測CD3d、CD4、LCK、IL-7R分子在病變組織中的表達情況，以探討淋巴組織增生及淋巴管生成的發(fā)病機理。

資料與方法

一、標本來源

選取2010年8月至2016年10月在首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院眼腫瘤?？七M行手術切除淚腺組織并經病理組織學確診的20例LGBLEL患者病變淚腺標本組織和10例單純眼眶海綿狀血管瘤患者瘤體組織。本實驗方案已通過首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會審查，并與患者簽署知情同意書。

二、取材

將手術切除的LGBLEL患者病變淚腺標本組織和眼眶海綿狀血管瘤患者瘤體組織先用PBS緩沖液沖洗干凈，去除血污，將標本分為兩部分，其中一部分放入凍存管中，置于-80 ℃冰箱低溫保存；另一部分用10%福爾馬林固定，并交由上海生工生物工程有限公司對標本進行石蠟包埋后切片，制作成石蠟切片。

三、主要耗材與試劑

兔抗人CD3d抗體和兔抗人CD4抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，鼠抗人LCK抗體和鼠抗人IL-7R抗體(美國 Abcam公司)，通用二步法試劑盒和DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司) 山羊血清(美國Gibco公司)等。

四、實驗方法

1.將石蠟切片烤片后經脫蠟、水化；抗原修復；阻斷內源性過氧化物酶；封閉；加一抗；加二抗；加DAB液、復染，脫水，封片等步驟行免疫組化染色后放倒置相差顯微鏡觀察切片的染色結果并照相。

2.免疫組化結果判讀：以CD3d、CD4、IL-7R細胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，LCK細胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。分別計數整體病變淚腺組織、增生淋巴濾泡、淋巴濾泡間區(qū)、腺泡4個部位的陽性表達率，在腺泡的表達只要一圈腺上皮中出現(xiàn)1個陽性細胞即算為陽性。采用半定量積分法(semi-quantitative immunoreactivity scores，IRS)計算整體病變淚腺組織陽性表達積分值。顯微鏡下低倍鏡下隨機觀察3個染色視野，轉換高倍鏡，對每個視野的陽性率(視野內陽性所占面積的百分比)及視野內染色程度分別進行分級計分，取3個視野的平均值。陽性細胞面積≤5%：0分、5%～25%：1分、25%～50%：2分、50%～75%：3分、≥75%：4分。著色強度依據深淺記分，無著色：0分、淺著色：1分、深著色：2分。根據兩項相乘的分數為最后的積分值：≤1.0為陰性(-)，1.1～2.0為弱陽性(+)，2.1～3.0為陽性(++)，3.1～4.0為陽性(+++)，≥4.0為強陽性(++++)。

結 果

免疫組織化學染色結果顯示：對照組單純眼眶海綿狀血管瘤CD3d、CD4、LCK、IL-7R均為陰性表達。實驗組病變淚腺組織CD3d、CD4、LCK、IL-7R表達結果(見圖1～4)。實驗組腺泡CD3d、CD4、LCK、IL-7R表達結果(見圖5～8)。

免疫組織化學染色結果顯示:CD3d在淋巴濾泡周圍陽性表達率高達85.5%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率高達51.8%，均呈深著色，總體最后的積分值，≥4.0為強陽性(++++)；CD4在淋巴濾泡周圍陽性表達率高平均約54.6%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率高達22.5%，均呈深著色，總體最后的積分值，3.1～4.0為陽性(+++)；LCK在淋巴濾泡周圍陽性表達率高平均約28.9%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率高達9.8%，均呈深著色，總體最后的積分值，2.1～3.0為陽性(++)；IL-7R在淋巴濾泡周圍陽性表達率高平均約9.7%，在淋巴濾泡間區(qū)陽性表達率平均約4.6%，均呈深著色，總體最后的積分值，1.1～2.0為陽性(+)；CD3d、CD4、LCK、IL-7R在腺上皮腺泡的表達呈現(xiàn)明顯差異，其中CD3d陽性表達率最高，表達約13.5%，并可見CD3d陽性細胞侵入腺泡現(xiàn)象，CD4陽性表達率次之，表達約4.5%，偶見侵入腺泡現(xiàn)象。LCK、IL-7R在腺泡的表達均呈陰性，未見侵入腺泡現(xiàn)象。對照組單純眼眶海綿狀血管瘤患者病變淚腺組織CD3d、CD4、LCK、IL-7R均表達陰性。見表1～2。

圖1 LGBLEL組織CD3d+10×10倍圖2 LGBLEL組織CD4+10×10倍圖3 LGBLEL組織LCK+10×10倍圖4 LGBLEL組織IL-7R+10×10倍圖5 LGBLEL腺泡CD3d+10×20倍圖6 LGBLEL腺泡CD4+10×20倍圖7 LGBLEL腺泡LCK-10×20倍圖8 LGBLEL腺泡IL-7R-10×20倍

表1 GBLEL患者整體病變淚腺組織、增生淋巴濾泡、淋巴濾泡間區(qū)、腺泡CD3d、CD4、LCK、IL-7R陽性表達率情況比較(%)

組別CD3dCD4LCKIL-7R整體病變淚腺組織68.738.619.47.2DW增生淋巴濾泡85.554.628.99.7增生淋巴濾泡間區(qū)51.822.59.84.6腺泡13.54.500

表2 GBLEL患者與單純眼眶海綿狀血管瘤患者病變淚腺組織CD3d、CD4、LCK、IL-7R整體表達情況比較

組別例數CD3dCD4LCKIL-7RGBLEL組20++++++++++單純眼眶海綿狀血管瘤組10----

討 論

LGBLEL是一種危害人類健康的眼科疾病，患者以中老年女性雙眼發(fā)病較為多見，臨床表現(xiàn)主要為雙眼或單眼無痛性眼瞼腫脹，眼眶MRI掃描顯示雙側或單側眼瞼腫脹伴淚腺彌漫性腫大、脫垂，病情遷延反復，存在一定的惡變傾向。病理改變表現(xiàn)為腺小葉結構仍存在，小葉內腺泡間有淋巴細胞浸潤，繼而腺泡破壞消失，為密集的淋巴細胞和組織細胞所代替，小葉內導管增生擴張，患者因導管上皮增生形成實性上皮團塊，表現(xiàn)為良性淋巴組織病變。

淋巴結為人體重要的免疫器官和防御屏障，廣泛分布于人體的皮膚、黏膜及血管周圍，常受到各種因子的刺激，如各類病原微生物感染、化學藥物、外來的毒物、異物、機體自身的代謝產物、變性壞死的組織成分等多種因素的都可作為抗原或致敏原刺激淋巴結內細胞成分，主要是淋巴細胞、組織細胞和樹突狀細胞的增生，導致淋巴結腫大。近來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在炎性病變條件下，淋巴管生成顯著增強。組織及血管間質有大量炎性細胞侵潤，他們能分泌多種促炎性細胞因子，參與了淋巴管的生成過程。這些促炎性細胞因子主要包括白細胞介素1α，IL-1β，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-4、IL-7、IL-8等[8]。 因此，在成人某些病理情況下，激活一套特殊的轉錄因子，可以通過轉變從毛細血管內皮細胞表型轉為淋巴管內皮細胞表型所需要的分子程序，來調節(jié)內皮細胞的分化[9]。

本實驗選用單純眼眶海綿狀血管瘤患者術后標本作為對照組，原因主要有以下3個[10]：(1)單純眼眶海綿狀血管瘤是一種已經被證明的先天性血管發(fā)育畸形，與炎癥反應和免疫作用無明顯相關，而LGBLEL目前認為是一種與炎癥和免疫反應相關的疾病。選用單純眼眶海綿狀血管瘤作為對照組不會對實驗組的研究目的有所干擾。(2)單純眼眶海綿狀血管瘤發(fā)病率較高，標本易收集。北京同仁醫(yī)院眼腫瘤科每年收治的單純眼眶海綿狀血管瘤手術標本近80例，故有較多的標本量供采用。(3)正常的淚腺組織難以獲取。

CD3分子主要存在于T細胞表面，由6條肽鏈組成，與T細胞受體結合參與TCR信號轉導，其主要功能是轉導T細胞受體識別抗原所產生的活化信號。CD3分子處于外周血中并是其中成熟的T 淋巴細胞中最好標志物(marker) 之一，測定CD3+T淋巴細胞對評價免疫缺陷癥、白血病、淋巴瘤的分型診斷具有重要意義。CD4分子是人類免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫分子，主要表達在Th細胞，是Th細胞識別抗原的受體，參與Th細胞識別抗原的信號轉導。CD4分子是T淋巴細胞的重要標志物，可檢測機體免疫功能、對白血病和淋巴瘤的免疫分型診斷及免疫抑制療法的評價具有重要意義。LCK又稱T淋巴細胞酪氨酸激酶，是效應T細胞形成的必要因子，在T細胞介導的免疫應答中具有重要作用，對LCK中的編碼基因在細菌誘導下的表達模式進行研究，可有助于揭示抗菌免疫的分子機制。白介素7受體(interleukin-7 receptor,IL-7R)是T淋巴細胞生長發(fā)育所必需的細胞因子，它可激活T細胞、B細胞、巨噬細胞 以及樹突狀細胞。IL-7R與自身免疫密切相關。起重癥聯(lián)合免疫缺陷病是由IL-7R在細胞表面的缺失所導致的。

本研究檢測了LGBLEL病變組織的CD3 d、CD4、LCK、IL-7R分子表達水平，免疫組化定位檢測發(fā)現(xiàn)CD3d在LGBLEL病變淚腺組織高表達，在增生淋巴濾泡的周邊部位表達明顯增高，在濾泡間區(qū)也表達增高，腺泡也可見浸潤性表達，說明CD3d陽性細胞即T淋巴細胞在LGBLEL病變淚腺組織發(fā)病中起主要作用；CD4陽性細胞偶見侵入腺泡現(xiàn)象。LCK、IL-7R在腺泡的表達均呈陰性，未見侵入腺泡現(xiàn)象。CD3d、CD4、LCK、IL-7R屬于原發(fā)免疫缺陷(primary immunodeficiency)通路的主要作用因子[11]，原發(fā)免疫缺陷通路是免疫反應中的較為少見的一條信號通路，它的功能及機制研究尚不明確，有研究顯示原發(fā)免疫缺陷通路在原發(fā)性免疫缺陷病和艾滋病等疾病的發(fā)病過程中起到重要作用，所以就體液免疫、細胞免疫、自身免疫及原發(fā)免疫缺陷等多種免疫通路選取恰當細胞因子對LGBLEL病變組織的間質、腺泡及所形成的淋巴濾泡進行定位標記，對揭示LGBLEL的病因及發(fā)病機制會有重要意義。

總而言之，本研究結果表明淚腺良性淋巴上皮病變組織標本中CD3d、CD4、LCK、IL-7R異常表達參與了LGBLEL的發(fā)病過程，但其詳細機制仍需進一步研究。

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UsingtheimmunohistochemicalexamtoanalysetheexpressionandclinicalsignificanceofCD3d,CD4,LCKandIL-7Rinlacrimalbenignlymphoepitheliallesion

LiuXiao，WangLei，MaJianmin，GeXin，LiJing，WangXiaona.

BeijingTongrenEyeCenter，BeijingKeyLaboratoryofOphthalmologyandVisualScience，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijng100730，China

ObjectiveDetecting the expression of CD3d,CD4,LCK,IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion and discussing whether it is related to the pathogenesis of lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion.MethodsUsing the immunohistochemical exam to detect the expression of CD3d,CD4,LCK,IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion and orbital cavernous hemangioma was considered as control group. The integral value of positive expression in the experimental group and the control group was calculated by semi quantitative immunoreactivity scores.ResultsThe expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R were elevated in LGBLEL. The positive rate of CD3d expression in the lymphoid follicle is as high as 85.5%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 51.8%, the overall score is strongly positive (+ + + +).The positive rate of CD4 expression in the lymphoid follicle is about 54.6%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 22.5%, the overall score is positive (+ + +). The positive rate of LCK expression in the lymphoid follicle is about 28.9%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 9.8%, the overall score is positive (++).The positive rate of IL-7R expression in the lymphoid follicle is about 9.7%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 4.6%, the overall score is positive (+).The expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R have showed the significant differences in the expression of glandular epithelial acinus, the positive expression of CD3 d is the highest, the expression rate is about 13.5%, and you can see the CD3d positive cells invade the acinar. The positive expression of CD4 is about 4.5%, and you can see the CD4 positive cells occasionally invaded acini. The expressions of LCK and IL-7R are negative in acini, there is no invasion of acini.The expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R were normal in orbital cavernous hemangioma.ConclusionThe increased expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion may participate in the pathogenesis of lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion.

Benign lymphoepithelial lesion;Lacrimal gland;Pathogenesis

[JClinOphthalmol,2017,25:385]

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.05.001

國家自然科學基金(編號：81371052)

100730 首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院

馬建民(Email:jmma@sina.com)

[臨床眼科雜志，2017，25：385]

(收稿：2017-05-22)