張?zhí)靷?，章劍君，何宏?/p>

(1.宛西中等專業(yè)學(xué)校，河南南陽 474350；2.社旗縣教師進(jìn)修學(xué)校，河南南陽 473300；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101)

河南省3株馬立克病病毒Meq基因的序列分析

張?zhí)靷?△，章劍君2△，何宏軒3*

(1.宛西中等專業(yè)學(xué)校，河南南陽 474350；2.社旗縣教師進(jìn)修學(xué)校，河南南陽 473300；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101)

根據(jù)GenBank收錄的馬立克病病毒(MDV)基因組序列的Meq基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用PCR方法從河南發(fā)病雞群中檢測(cè)出了3株MDV，將目的片段克隆，并進(jìn)行測(cè)序，獲得Meq基因全長(zhǎng)序列，將3株MDV的Meq基因與GenBank上收錄的不同類型毒株進(jìn)行比較分析。3株MDV的Meq基因段長(zhǎng)度均為1 020 bp，核苷酸序列分析表明，河南株Meq基因與其他MDV核苷酸同源性為98.6%，氨基酸同源性為96.5%；Meq基因的氨基酸序列共有9個(gè)位點(diǎn)的氨基酸存在突變；遺傳進(jìn)化分析表明這些毒株有3個(gè)分支，其中Henan 1～3株、ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)位于同一個(gè)分支，vMDV GA(AF147806.1)、vvMDV RBIB(AY243332.1)位于同一個(gè)分支，mMDV CVI988(AF493555.1)和中國(guó)疫苗株814(AF493551)位于同一個(gè)分支。

馬立克病病毒；聚合酶鏈反應(yīng)；Meq基因；序列分析

雞馬立克病(Marek's disease，MD)是由雞馬立克病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的腫瘤性傳染病，典型特征為淋巴組織增生，傳染性很強(qiáng)，雞是主要的發(fā)病宿主，其他禽類較少發(fā)生[1]。MDV分為3個(gè)血清型，即血清1型(MDV-1)，血清2型(MDV-2)和血清3型(MDV-3)，其中只有MDV-1具有致瘤性或致病力[1-2]。MDV-1是MDV群的原型病毒，包括對(duì)宿主具有毒力或致瘤性的強(qiáng)毒分離株及其致弱變異株；MDV-2是從雞分離的病毒，無致病性；MDV-3是從火雞分離的病毒，無致病性，常用于制備疫苗[3-4]。根據(jù)毒力的強(qiáng)弱，可將MDV-1分為溫和毒株(mild MDV，mMDV)、強(qiáng)毒MDV(virulent MDV，vMDV)、超強(qiáng)毒MDV(very virulent MDV，vvMDV)以及特超強(qiáng)毒MDV(very virulent plus MDV，vv+MDV)[1]。Meq基因是MDV-1毒株特有的基因，為MDV的致瘤基因，其N末端具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，C末端具有富含脯氨酸重復(fù)區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活域[5-9]。MD的預(yù)防與控制當(dāng)前仍需通過疫苗免疫來進(jìn)行[9]。近年來中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，禽類貿(mào)易大幅上升，同時(shí)MDV對(duì)常規(guī)疫苗的抵抗力也在逐漸增加，新出現(xiàn)的毒力增強(qiáng)的毒株能突破傳統(tǒng)MD疫苗的免疫保護(hù)，因此，在疫苗免疫雞群中常發(fā)生野毒株的感染，且致病力也呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，MD還可導(dǎo)致病雞的免疫抑制，病雞免疫力降低，引起繼發(fā)感染，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害，威脅人類食品安全[9-11]。

2016年-2017年，河南省部分養(yǎng)雞場(chǎng)疫苗免疫雞群發(fā)生MD的流行，本研究對(duì)病雞進(jìn)行了臨床診斷和病原檢測(cè)，并對(duì)3個(gè)MDV毒株的Meq基因進(jìn)行測(cè)序，將其與8株MDV-1參考毒株進(jìn)行了比較分析，旨在了解這些分離株的遺傳變異特征及可能的致病性。

1 材料與方法

1.2 材料

1.1.1 病料、雞胚 3只雞的腫瘤組織病料由宛西中等專業(yè)學(xué)校2016年-2017年從河南省3個(gè)規(guī)?；u場(chǎng)采集并保存；SPF雞胚購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 病毒基因組DNA提取試劑盒Viral DNA Kit、2×EsTaqMasterMix、 DNA Marker DL 2 000購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；核酸膠回收試劑盒、pEASY-T1克隆載體、感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中收錄的MDV GA株(Genbank：AF147806.1)的全基因序列，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物PF:5′-AGAGATGTCTCAGGAGCCAGAG-3′；下游引物PR:5′-TCATCAGGGTCTCCCGTCACCT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 027 bp，該目的片段包括了Meq基因全長(zhǎng)1 020 bp，引物由Invitrogen公司合成后，稀釋為20 μmol/L，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒基因組DNA提取 將病雞的肝臟研磨，凍融3次，取200 μL研磨上清液，采用DNA提取試劑盒Viral DNA Kit提取病毒DNA。SPF雞胚采取同樣操作提取DNA，作為陰性對(duì)照。

1.2.3 PCR檢測(cè)MDV及目的片段的克隆、測(cè)序 以提取的DNA為模板，30 μL PCR反應(yīng)體系：2×EsTaqMastermix 15 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 12 μL；反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；94 ℃ 45 s，57℃ 30 s，72 ℃ 1min，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。將電泳檢測(cè)為陽性的目的條帶用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收純化后克隆入pEASY-T1載體，再轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Trans5α。菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性后，搖菌，提取質(zhì)粒，送華大基因公司測(cè)序。

1.2.4 Meq基因序列分析 測(cè)序成功后，截取Meq基因，用DNAStar 7.1 軟件的MegAlign功能對(duì)MDV河南株和參考毒株序列進(jìn)行序列比對(duì)分析及遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 病雞剖檢病變

病雞內(nèi)臟多器官出現(xiàn)腫瘤，肝臟尤為嚴(yán)重，腫瘤呈圓形，有的腫瘤較小，數(shù)量多(圖1A)；有的腫瘤大，數(shù)量較少(圖1B)。腫瘤突出于肝臟表面，灰白色，切面呈脂肪樣。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增到了1 027 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖2)。

2.3 MDV Henan株Meq基因的核苷酸序列分析

將鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為MDV Henan 1、MDV Henan 2、MDV Henan 3，成功測(cè)序后，獲得Meq基因全長(zhǎng)。從GenBank下載MDV-1 Meq基因序列，包括中國(guó)疫苗株814(AF493551)、mMDV CVI988(AF493555.1)、vMDV GA(AF147806.1)、vvMDV RBIB(AY243332.1)、vv+MDV毒株648A(AY362725.1)，國(guó)內(nèi)近幾年分離毒株，包括ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)，與河南株進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)。結(jié)果表明，參考毒株中國(guó)疫苗株814(AF493551.1)和mMDV CVI988(AF493555.1)Meq基因核苷酸序列大小均為1 017 bp，Henan株和其余參考毒株Meq基因核苷酸序列大小均為1 020 bp。對(duì)Henan株與MDV參考毒株Meq基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)這些MDV分離株之間或分離株與參考毒株之間的核苷酸同源性為98.6%～100%。Henan 1和Henan 3同源性為100%，它們與Henan 2同源性為99.9%。Henan株和參考毒株比較發(fā)現(xiàn)，其與國(guó)內(nèi)近幾年分離毒株ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)的同源性最高(圖3)。

A.肝臟腫大，布滿大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)；B.肝臟中較大的腫瘤結(jié)節(jié)

A.Hepatomegaly,and liver full of different sizes of tumor nodules; B.Larger tumors in liver

圖1病雞肝臟病變

Fig.1 Pathological lesions in the liver of the sick chicken

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～3.雞；4.陰性對(duì)照(SPF雞胚)

M.DNA Marker DL 2 000；1-3.Chickens; 4.Negative control (SPF chicken embryo)

圖2 PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 The results of PCR detection

2.4 MDV Henan株Meq基因的氨基酸序列分析

將MDV Henan株Meq基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他毒株的進(jìn)行比較。這些MDV毒株之間的氨基酸同源性為96.5%～100%(圖略)，Henan 1和Henan 3株完全相同，與Henan 2株僅有1個(gè)氨基酸的差異。如圖4所示，Henan 1～3株Meq基因氨基酸序列在第77、80、88、93、115、139、176和217位氨基酸和其他毒株不同，這些位置的變化與毒株毒力的變化存在一定的關(guān)系，這樣的結(jié)果施維松等在報(bào)道中的結(jié)果一致[3]。其中Henan 1～3株第93位由谷氨酰胺Q突變?yōu)榫彼酭為獨(dú)有的，和其他毒株均不相同。此外Henan 2的125位氨基酸突變?yōu)榫彼酭，其他毒株均為脯氨酸P，需要特別注意。近幾年國(guó)內(nèi)分離的毒株80、115、176、217位氨基酸分別變?yōu)槔野彼醂、丙氨酸A、精氨酸R、丙氨酸A。低毒力MDV具有脯氨酸重復(fù)區(qū)，高毒力MDV在脯氨酸重復(fù)區(qū)有點(diǎn)突變，破壞了4個(gè)連續(xù)的P(如PPPP-，PXPP)，毒力越強(qiáng)發(fā)生突變的次數(shù)越多[3]。本次河南株在脯氨酸重復(fù)區(qū)有2處突變(176和217位)，符合高毒力毒株的變異特征。

圖3 MDV Henan株與參考毒株Meq基因核苷酸序列同源性比對(duì)

圖4 MDV河南株與參考毒株Meq基因編碼的氨基酸序列的比較

2.5 MDV河南株Meq基因的遺傳進(jìn)化分析

用MegAlign構(gòu)建MDV河南株和參考毒株的Meq基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，發(fā)現(xiàn)這些分離株和參考株主要組成了3個(gè)分支，其中Henan株及國(guó)內(nèi)近幾年分離毒株ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)位于同一個(gè)分支，vMDV GA(AF147806.1)和vvMDV RBIB(AY243332.1)位于同一個(gè)分支，mMDV CVI988(AF493555.1)和中國(guó)疫苗株814(AF493551)位于同一個(gè)分支。Henan株及國(guó)內(nèi)的近幾年的分離毒株和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)親緣關(guān)系更近。

圖5 Meq基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

本研究所檢測(cè)出的3株MDV毒株來自河南省的3個(gè)MD疫苗免疫雞群。表明MDV能突破MDV疫苗的免疫保護(hù)，造成感染和流行。相關(guān)研究表明，Meq基因與MDV的致腫瘤性有關(guān)[3,9,12-13]。Meq基因序列比較保守，不同毒株間核苷酸和氨基酸序列的同源性很高[3,9]。Meq基因序列分析結(jié)果表明，MDV Henan 1株和Henan 3株的Meq核苷酸序列相同，它們與Henan 2相似度為99.9%，相似度很高，有可能在河南省這些雞場(chǎng)流行的是同一株MDV。比較的所有毒株之間核苷酸同源性為98.6%～100%，氨基酸同源性為96.5%～100%，Henan株與近幾年國(guó)內(nèi)分離毒株的同源性最近。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，Henan株及參考的國(guó)內(nèi)近幾年的分離毒株和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)親緣關(guān)系更近，說明這次在免疫雞群中流行的Henan株可能為強(qiáng)毒株。Meq基因氨基酸突變和MDV毒株毒力具有一定的關(guān)系[3]。強(qiáng)毒株Meq基因的ORF全長(zhǎng)1 020 bp，編碼339個(gè)氨基酸，而疫苗毒株CV1988和mMDV CVI988株的Meq基因中缺失3個(gè)堿基CAC，導(dǎo)致編碼的氨基酸第194位一個(gè)脯氨酸P的缺失。低毒力的毒株具有脯氨酸重復(fù)區(qū)，最強(qiáng)毒力毒株有3處突變(153脯氨酸P突變?yōu)镼、176位脯氨酸突變?yōu)楸彼酇和217位脯氨酸突變?yōu)楸彼酇)，可以打斷脯氨酸重復(fù)區(qū)。本試驗(yàn)3個(gè)毒株在第153位沒有氨基酸突變，但在176、217位氨基酸分別由脯氨酸P變?yōu)榫彼酭，脯氨酸P變?yōu)楸彼酇，打斷了脯氨酸重復(fù)區(qū)序列，具有強(qiáng)毒株的序列特征。MDV毒株Meq基因氨基酸的這些突變可能影響Meq的轉(zhuǎn)錄激活且與毒株毒力的關(guān)系具有一定的規(guī)律性，這些內(nèi)容還有待進(jìn)一步研究。

MD疫苗作為世界上第一種有效的動(dòng)物癌癥疫苗，對(duì)預(yù)防MD起關(guān)鍵作用。雖然目前已有多種MD疫苗如SB1苗、814苗、HVT苗，但MDV對(duì)常規(guī)疫苗的抵抗力也在逐漸增加，vvMDV和vv+MDV能突破MD疫苗的免疫保護(hù)，因此在疫苗免疫雞群中常發(fā)生野毒株的感染，造成嚴(yán)重危害。本研究在2016年-2017年發(fā)生MD的免疫雞群檢測(cè)出3株MDV，并對(duì)病毒的Meq基因進(jìn)行序列分析，為MDV的分子生物學(xué)研究和流行病學(xué)調(diào)查提供了資料。

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SequenceAnalysisofMeqGeneofThreeMarek’sDiseaseVirusStrainsinHenanProvince

ZHANG Tian-wei1,ZHANG Jian-jun2,HE Hong-xuan3

(1.WanxiTechnicalSchool，Nanyang，Henan474350,China； 2.SheqiTeacherTrainingSchool，Nanyang，Henan474350,China； 3.InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing，100101，China)

To investigate genetic variation of Marek’s disease virus(MDV) in Henan province,one pair of primers for amplifying Meq gene of MDV were designed according to nucleotide sequence in GenBank,and three isolates of MDV were detected from infected chickens by PCR.Targeted fragments were cloned and sequenced,then compared with different types of reference MDV strains published in GenBank.The results showed that Meq gene from the three MDV isolates consisted of 1 020 bp.Compared with reference strains published in GenBank,the sequences of Meq gene in different isolates were relatively conserved and the homologies of nucleotide and amino acid sequences of the isolates were more than 98.6% and more than 96.5%.The isolates displayed amino acid site mutations at 9 positions．Phylogenetic analysis showed that the isolates and strains could be separated into three groups．The Henan1-3 strains,ZC2014 (KP144356.1),YLO40920 (DQ174459.1),HNXZ106 (HF546099.1),and vv+MDV648A (AY362725.1) were clustered into one group,vMDV GA(AF147806.1),vvMDV RBIB (AY243332.1) clustered into the second group,and mMDV CVI988(AF493555.1) and Chinese vaccine 814 strains (AF493551) were clustered into the third group.

MDV; PCR; Meq gene; sequence analysis

2017-03-31

張?zhí)靷?1966-)，男，河南南陽人，本科，主要從事獸醫(yī)學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*

S855.3

A

1007-5038(2017)12-0073-05