馬菊紅，雷琦敬，倪迎冬，李 賢，殷玉鵬，李國紅，胡小宏，張 艷，陳樹林*，叢日華*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；3.陜西省城固縣畜牧獸醫(yī)工作站，陜西漢中 723200；4.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?571100)

高精料日糧對泌乳期奶山羊脂肪代謝的影響

馬菊紅1，雷琦敬1，倪迎冬2，李 賢1，殷玉鵬1，李國紅1，胡小宏3，張 艷4，陳樹林1*，叢日華1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；3.陜西省城固縣畜牧獸醫(yī)工作站，陜西漢中 723200；4.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南海口 571100)

為了探究長期飼喂高精料日糧對泌乳期奶山羊乳脂形成的影響機(jī)制，為科學(xué)飼養(yǎng)泌乳期的奶山羊提供理論基礎(chǔ)。選用處于泌乳初期的14只關(guān)中奶山羊，隨機(jī)分為2組，飼喂日糧精粗比為35∶65的作為對照組，65∶35的作為試驗(yàn)組，試驗(yàn)期為19周。結(jié)果表明，與對照組相比，飼喂高精料日糧的奶山羊血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度顯著升高(P<0.05)，甘油三酯有降低的趨勢；試驗(yàn)組肝細(xì)胞呈腫脹變性或空泡樣變性；與對照組相比，試驗(yàn)組奶山羊肝臟內(nèi)脂類的分解和合成代謝相關(guān)基因表達(dá)均未發(fā)生顯著變化。說明長期飼喂高精料日糧可導(dǎo)致血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，這可能與肝細(xì)胞受損有關(guān)，但脂類代謝的相關(guān)基因表達(dá)均沒有發(fā)生顯著變化。

高精料日糧；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；甘油三酯；脂代謝

在過去的幾十年里，經(jīng)過激烈的品種選擇，奶牛營養(yǎng)和奶牛管理的改善等顯著提高了奶牛產(chǎn)奶量，尤其是在荷斯坦牛的品種上。眾所周知，這些在提高產(chǎn)奶性能的同時(shí)，也伴隨著一些負(fù)面的影響，例如代謝性疾病發(fā)病率的增加和繁殖性能的降低[1-4]。研究表明，采食量遺傳優(yōu)勢的增加并不能同時(shí)增加產(chǎn)奶量的遺傳優(yōu)勢，表示篩選高遺傳性狀產(chǎn)奶量的奶牛只有通過增加采食量進(jìn)行部分的補(bǔ)償[5]。因此，在現(xiàn)代奶業(yè)生產(chǎn)中，飼喂高精料日糧成了保持高產(chǎn)乳量進(jìn)而追求高經(jīng)濟(jì)效益的一種策略。研究發(fā)現(xiàn)，用富含可發(fā)酵的碳水化合物的日糧飼喂反芻動物可引起瘤胃微生物的組成和代謝發(fā)生改變，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸在瘤胃內(nèi)積累，引起瘤胃PH急劇下降[6-7]。對于反芻動物來說，日糧中的大部分碳水化合物和蛋白質(zhì)是通過瘤胃微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)變成揮發(fā)性脂肪酸，即乙酸、丙酸和丁酸，隨后在腸道內(nèi)被吸收。丙酸作為肝糖異生的主要前體物質(zhì)用來合成內(nèi)源性的葡萄糖，而乙酸和丁酸被用來合成脂類[8]。肝臟在脂肪代謝的調(diào)控中起著非常重要的作用,幾乎所有的有關(guān)脂肪代謝的反應(yīng)都在肝臟中進(jìn)行，是調(diào)控脂肪酸代謝去路的重要器官，對乳脂合成非常重要。已有研究表明，飼喂高精料的日糧可以增加乳腺脂肪酸的從頭合成，導(dǎo)致乳脂增加，但是降低了肝臟中的脂質(zhì)合成[9-10]。所以，本研究以關(guān)中奶山羊?yàn)閯游锬Ｐ?，來模擬實(shí)際生產(chǎn)中的喂養(yǎng)模式，通過在日糧中添加高比例的精料來揭示長期飼喂高精料日糧對關(guān)中奶山羊血液生化指標(biāo)和肝臟脂代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，為科學(xué)飼養(yǎng)泌乳期的奶山羊提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 試驗(yàn)選用14頭體重相近、健康狀況良好，泌乳初期的經(jīng)產(chǎn)2胎～3胎的關(guān)中奶山羊，飼養(yǎng)于陜西楊陵西北農(nóng)林科技大學(xué)牧場，隨機(jī)分為2組，在試驗(yàn)期間可自由飲水，每日活動2次。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol總RNA 提取試劑盒、DNA酶(DNaseI)、RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。4℃離心機(jī)，電動勻漿器，水浴鍋，紫外分光光度計(jì)，Real-time PCR儀(Bio-Rad,Kodak,USA)。生化指標(biāo)由西北農(nóng)林科技大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將14只泌乳初期的關(guān)中奶山羊隨機(jī)分為2組，對照組6只，試驗(yàn)組8只，高精料組飼喂精粗比為65∶35的日糧，對照組飼喂精粗比為35∶65的日糧，飼喂3個(gè)月。日糧的配方詳見表1。

表1 日糧的配方

1.2.2 樣品采集與處理 飼養(yǎng)19周后，對奶山羊過夜禁食12 h，稱重，頸靜脈放血處死，采集肝臟、胃腸道、肌肉等樣品，置-80℃保存，組織學(xué)檢查樣品多聚甲醛固定，保存。

1.2.2.1 血液的采集和處理 用肝素鈉真空離心管采集頸靜脈血液，在4℃采用3 500 r/min離心15 min，收集血清，置-20℃保存。測定血液生化指標(biāo)，取頸靜脈血血象分析儀測定血項(xiàng)(西北農(nóng)林科技大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測定)。

1.2.2.2 肝臟組織病理學(xué)檢測 取相同部位肝臟組織塊2 cm×2 cm×2 cm放入40 mL/L的多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)固定液中固定至少48 h，按常規(guī)操作步驟制作石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化。

1.2.2.3 樣品采集處理與熒光定量PCR檢測 奶山羊頸靜脈放血處死，立即將肝臟組織剝離，取相同部位肝臟分子樣品放入液氮，1 d后，將其轉(zhuǎn)入-80℃保存待測。Trizol法提取肝臟組織的總RNA，NanoDrop測定RNA樣品的濃度和純度。根據(jù)TaKaRaPrime ScriptTMRTKit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)參照SYBR Green Real-time PCR Master Mix Kit試劑盒說明書進(jìn)行。以PPIA作為內(nèi)標(biāo)，結(jié)果分析采用2-△△CT法。所用引物采用Primer3.0軟件自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 飼喂高精料日糧對血液生化指標(biāo)的影響

由表3顯示，與對照組相比，飼喂高精料日糧的試驗(yàn)組奶山羊血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度顯著升高(P<0.05)，甘油三酯有下降的趨勢(P>0.05)，但是，在長期飼喂高精料日糧的條件下，血液中大部分的生化指標(biāo)并沒有發(fā)生顯著性的變化(P>0.05)。

表3 飼喂高精料日糧對血液生化指標(biāo)的影響

注：*表示組間差異顯著(P<0.05)，#表示組間有差異趨勢(P<0.1)，(n=14)。P值是均值+SEM。

Note：*P<0.05 means significant difference between two groups,#P<0.1 means a different tendency between two groups(n=6).P values are means +SEM.

2.2 高精料日糧對肝臟病理變化的影響

對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密完整，胞質(zhì)均勻。高精料組肝細(xì)胞高度腫脹，體積變大，胞漿溶解，肝細(xì)胞呈腫脹變性或空泡樣變性(圖1)。

2.3 高精料對肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對照組相比，長期飼喂高精料的試驗(yàn)組奶山羊肝臟脂代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)均未發(fā)生顯著性變化(P)，雖然在長期飼喂高精料日糧的條件下，試驗(yàn)組肝臟脂代謝基因LPL、SCD、FADS2 mRNA的表達(dá)量有所升高，但是卻沒有達(dá)到顯著的水平(圖2)。

3 討論

3.1 飼喂高精料日糧對血液生化指標(biāo)的影響

為了提高奶畜的生產(chǎn)性能，以及牧草缺乏和品質(zhì)低下，生產(chǎn)中通常大量飼喂精飼料以滿足奶牛高產(chǎn)奶的需求。反芻動物飼喂高精料日糧極易導(dǎo)致瘤胃酸中毒，引起機(jī)體消化吸收和代謝功能的損壞，乳品質(zhì)下降，飼料轉(zhuǎn)化率降低并且影響了動物的健康和福利。本病的臨床表現(xiàn)是牛的采食量和產(chǎn)奶量降低、蹄葉炎、肝膿腫和瘤胃微生物量及發(fā)酵產(chǎn)物的改變[11]。正常情況下，谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于細(xì)胞內(nèi),在血清中的活性較低，在心臟和肝臟的活性最高。因此，當(dāng)這些組織細(xì)胞受損時(shí)，可有大量的谷丙轉(zhuǎn)氨酶逸入血液，造成血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性明顯升高[12]。另一方面，轉(zhuǎn)氨酶還參與了主要在肝、腎等組織中進(jìn)行的聯(lián)合脫氨基作用，這一過程是體內(nèi)合成非必需氨基酸的重要途徑，因此其活性在一定程度上還可以反應(yīng)氨基酸的代謝強(qiáng)度。左之才[13]等研究發(fā)現(xiàn)高能量日糧的攝入可以增加圍產(chǎn)期健康奶牛的血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧的精粗比能影響血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic Pyruvictransaminase，GPT)的活性，飼喂高精料日糧的試驗(yàn)組奶山羊血漿GPT濃度顯著升高，提示肝功能有一定程度的損傷，可能是由于飼喂高精料日糧，引起瘤胃酸中毒，內(nèi)源性脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)經(jīng)肝門靜脈進(jìn)入肝臟，對肝臟造成一定程度的損傷及肝臟功能(如糖異生作用，脂代謝，轉(zhuǎn)氨基作用等)下降，大量的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液。

圖1 HE染色觀察高精料日糧對奶山羊肝臟病理變化的影響(40×)

*表示組間差異顯著,n=14 *P<0.05 means significant difference between two groups，n=14

反芻動物血液中的甘油三酯(TG)參與機(jī)體能量代謝，同時(shí)也可以作為合成乳脂的原料物質(zhì)。Dong H B等[14]研究表明，給泌乳中期的奶山羊飼喂10周的高精料日糧后，血液中的甘油三酯濃度顯著降低。本試驗(yàn)中，在飼喂高精料日糧19周后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組山羊血液中的甘油三酯具有下降的趨勢，同之前的研究報(bào)道的結(jié)果基本一致。血液中甘油三酯的降低可能由于機(jī)體為了適應(yīng)高能量的需求，脂肪被動員進(jìn)行了脂肪酸的β-氧化供能，消耗了合成乳脂的前體物質(zhì)。姜雪元等[15]研究表明，在飼喂6∶4精粗比日糧的條件下，肝臟脂的分解代謝增強(qiáng)，糖異生作用下降，乳腺中合成TG的前體物質(zhì)被競爭性的消耗。

3.2 飼喂高精料對肝臟脂代謝基因表達(dá)的影響

膳食纖維、碳水化合物和蛋白質(zhì)為瘤胃發(fā)酵提供了底物并且在瘤胃內(nèi)發(fā)酵成揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，揮發(fā)性脂肪酸主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，乙酸鹽和丁酸鹽是生成脂類的前體物質(zhì)，而丙酸鹽是肝糖異生的主要前體物質(zhì)[8]。瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸和來源于日糧的長鏈脂肪酸等都是從胃腸道吸收通過門靜脈匯集入肝臟[16]，這些物質(zhì)均為乳脂合成的前體物質(zhì)。Miyazaki M等[17]的研究表明，用高碳水化合物喂養(yǎng)小鼠可以引起肝臟內(nèi)的SCD1基因的蛋白表達(dá)和酶活性都急劇升高。SCD是不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶，催化飽和的長鏈脂肪酸形成單不飽和脂肪酸棕櫚酸和油酸[18]。脂肪酸脫氫酶2(FADS2)催化2種必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸最后脫氫形成長鏈多不飽和脂肪酸[19]。這兩種酶催化分解的產(chǎn)物分別為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，有研究表明，普通牛奶中飽和脂肪酸：單不飽和脂肪酸：多不飽和脂肪酸通常為70∶25∶5[20]。本研究結(jié)果顯示，飼喂高精料日糧的試驗(yàn)組山羊肝臟脂代謝基因SCD和FADS2 mRNA的表達(dá)量有所升高，但是卻未達(dá)到顯著的水平，這些基因的變化可能影響了血液中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的比例，從而影響了乳脂中脂肪酸的組成及比例。

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EffectsofHigh-concentrateDietonBloodBiochemicalParametersandHepaticLipidMetabolisminLactatingDairyGoats

MA Ju-hong1,LEI Qi-jing1,NI Ying-dong2,LI Xian1,YIN Yu-peng1, LI Guo-hong1,HU Xiao-hong3,ZHANG Yan4,CHEN Shu-lin1,CONG Ri-hua1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jingsu,210095,China; 3.ChengguCountyAnimalHusbandryandVeterinarystation,Hanzhong,Shaanxi,723200,China;4.InstituteofAnimialHusbandry,HannanAgriculturalAcademy,Haikou,Hainan,571100,China)

The purpose of this study was to explore the effect of long-term feeding of high-concentrate diets on the formation mechanism of milk and provide a theoretical basis for scientific breeding of lactating dairy goats.In this study,14 early-lactation Guanzhong dairy goats were selected and randomly divided into two groups:the control group was fed 35% concentrate of dry matter,and fed 65% concentrate of dry matter as the experimental group.The experiment lasted for 19 weeks.Compared with the control group,the concentration of glutamic-pyruvic transaminase was up-regulated significantly (P<0.05) and triglyceride has a tendency to decrease in blood of dairy goats fed high-concentrate diets.In the experimental group,the hepatic cells showed swelling degeneration or vacuolar degeneration.However,there was no significant difference in the lipid metabolism and anabolism related gene expression between the experimental group and the control group.The results of this study showed that long-term feeding of high-concentrate diets can lead to increased blood glutamic-pyruvic transaminase,suggesting that this may be related to liver cell damage,but the expressions of genes related to lipid metabolism were not significantly changed.

high-concentrate diet; glutamic-pyruvic transaminase; triglyceride; lipid metabolism

2017-03-12

陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(K3310215109)； 陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016JM3033);海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016017)

馬菊紅(1989-)，女，山西臨汾人，碩士研究生，主要從事分子營養(yǎng)生理學(xué)研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0044-05