趙素君，曹 冶，謝 晶，于吉峰，李江凌，王秋實，廖黨金

(1.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066)

奶牛源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及氟苯尼考耐藥基因fexA的克隆

趙素君1,2*，曹 冶1,2，謝 晶1,2，于吉峰1,2，李江凌1,2，王秋實1,2，廖黨金1,2

(1.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066)

從100個奶牛場環(huán)境及膿汁樣品中分離、鑒定了9株奶牛源耐氟苯尼考金黃色葡萄球菌，分別提取質粒DNA和基因組DNA，通過特異性引物進行PCR擴增氟苯尼考耐藥基因fexA，以質粒DNA為模板的PCR分別擴增出了1 446 bp特異性目的片段，而以基因組DNA為模板的PCR未擴增出該目的片段。將該目的片段克隆到pET-32(a)載體上，成功構建了pET-fexA質粒載體，將質粒載體轉入BL21中，藥物敏感性試驗顯示構建的pET-fexA/BL21基因工程菌對氯霉素和氟苯尼考高度耐藥。同時，fexA陽性金黃色葡萄球菌分離株對氯霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著高于質控菌株，說明fexA基因貢獻細菌對氯霉素和氟苯尼考的交叉耐藥。成功構建了一個基因背景清楚且對氟苯尼考耐藥的細菌模型，排除了細菌中其他氟苯尼考耐藥基因或泵出蛋白對fexA基因貢獻細菌耐藥的影響，為fexA基因編碼的蛋白定位研究奠定了基礎。

金黃色葡萄球菌；氟苯尼考；fexA基因；奶牛

近年來，我國奶牛業(yè)向規(guī)?；⒓s化方向發(fā)展，奶牛飼養(yǎng)規(guī)模逐漸擴大。奶牛乳房炎是阻礙奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最主要的疾病之一，導致嚴重的經濟損失。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是一種重要的人畜共患病病原，是奶牛乳房炎三大主要病原菌之一，同時也能危害奶牛的生產性能，造成子宮內膜炎及其他疾病[1-4]。氟苯尼考是氯霉素類廣譜抗生素，由其同系物甲砜霉素分子結構改造而來，具有更好的安全性和抗菌效果，是氯霉素和甲砜霉素的理想替代物。20世紀90年代以來氟苯尼考開始在全球范圍內使用，因其廣譜、高效、吸收迅速、分布廣泛、安全等特點，成為應用最廣泛的獸用抗生素之一，常用于獸醫(yī)臨床金黃色葡萄球菌感染的治療。但隨著用藥量的增多，耐藥性問題也日漸嚴重，一方面給臨床治療帶來困難，另一方面動物源耐藥菌還可通過食物鏈感染人體或將耐藥基因轉移至人體病原菌，給食品安全和人體健康帶來潛在危害，也給研究者提出了新的研究熱點。

目前，在葡萄球菌中已發(fā)現cfr和fexA2種氟苯尼考耐藥基因。2004年，Kehrenberg等[5]首次報道了從緩慢葡萄球菌的質粒pSCFS2上克隆到一種新的耐氟苯尼考fexA基因，編碼的蛋白由475個氨基酸組成，有14個跨膜區(qū)。fexA基因是首個從革蘭陽性球菌鑒定出的編碼外排泵的基因，是E-4族成員，與其他氯霉素類藥物的外排泵基因同源性很低，可同時介導對氯霉素和氟苯尼考耐藥。與其他外排蛋白不同的是，在fexA基因上游存在1個類似衰減子的結構，因此fexA基因的誘導表達可通過翻譯衰減來進行調節(jié)。自該基因首次發(fā)現后，動物源和人源葡萄球菌的耐氟苯尼考fexA基因相繼報道。有研究在12株葡萄球菌中檢測到fexA基因，其中有3株分別為豬源、人源、馬源金黃色葡萄球菌[6]；Argudin M A等[7]在豬、豬場的土壤、牛奶及肉品中的金黃色葡萄球菌中也發(fā)現了fexA基因。大量研究表明，除了動物源細菌，人源的氟苯尼考耐藥菌株也不斷被發(fā)現[8-9]，可見氟苯尼考的耐藥性問題日益嚴重，研究其耐藥機制，對于食品安全和人類健康具有重要的公共衛(wèi)生學意義。本研究從四川規(guī)?；膛龅沫h(huán)境樣本中分離耐氟苯尼考金黃色葡萄球菌，檢測氟苯尼考耐藥基因fexA并對其耐藥性進行分析，為金黃色葡萄球菌對氟苯尼考耐藥機制的深入研究提供理論依據，從而更好地控制耐藥性傳播，保障養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌CVCC3055購自中國獸醫(yī)藥品檢查所中國獸醫(yī)微生物菌種保存管理中心，作為質控菌株。大腸埃希菌JM109、BL21為動物遺傳育種四川省重點實驗室保存。

1.1.2 樣品采集 采集四川省5個不同的奶牛養(yǎng)殖場的環(huán)境及化膿組織樣品100個。

1.1.3 主要試劑TaqDNA聚合酶，dNTPs，DL2000 DNA Marker，限制性內切酶SacⅠ、BamHⅠ，為寶生物工程(大連)有限公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒，質粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，為AXYGEN公司產品；pET-32(a)載體，為Novagen公司產品；氟苯尼考、氯霉素等，為杭州微生物試劑有限公司產品。其他試劑均為國產分析純試劑；引物合成及核酸測序由Invitrogen公司完成。

1.1.4 引物設計與合成 根據GenBank中葡萄球菌耐氟苯尼考fexA基因、金黃色葡萄球菌編碼耐熱核酸酶的nuc基因序列設計引物如下：fexA-F:5′-GATGAGCTCATGAAAAAGGATAGTAAATCTAAAG-3′(含SacⅠ酶切位點)，fexA-R:5′-CGCGGATCCTTACCCACGCTTTTTTAAACCT-3′(含BamHⅠ酶切位點)，擴增目的片段長度為1446 bp；nuc-F:5′-TTAGCCAAGCCTTGACGA- AC-3′，nuc-R:5′-AGGGCAATACGCAAAGAGGT-3′，擴增目的片段長度為480 bp。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 在無菌條件下，從養(yǎng)殖糞污及化膿組織取樣。糞污樣品先用1 mL的生理鹽水稀釋，再吸取100 μL置于滅菌的高鹽LB肉湯中，37℃培養(yǎng)10 h～12 h；用接種環(huán)挑取菌液劃線于含8 mg/L氟苯尼考的甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。將疑似葡萄球菌單菌落劃線接種于血瓊脂平板，于37℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單個優(yōu)勢菌落在血瓊脂平板上再次劃線，獲得純培養(yǎng)的菌株。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學觀察及生化鑒定試驗 將菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落的大小、形態(tài)，同時革蘭染色，光學顯微鏡觀察細菌形態(tài)特征，并采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)(bioMerieux公司，VITEK 2 Compact System)進行生化鑒定。

1.2.3fexA基因的PCR擴增及攜帶fexA基因的陽性菌株的鑒定 將上述分離的疑似金黃色葡萄球菌菌株進行培養(yǎng)，分別提取質粒DNA和基因組DNA，通過PCR擴增目的基因fexA，以質控菌為對照。對攜帶fexA基因的菌株，進一步進行nuc基因的測定，來確定金黃色葡萄球菌菌株。nuc基因是耐熱核酸酶的編碼基因，為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性，因此，很多研究以nuc基因作為擴增的靶基因[10-11]。

PCR反應體系：10×ExTaqbuffer(含MgCl2)2.5 μL，dNTP mixture(各2.5 mmol/L)2 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，TaKaRa ExTaq(5 U/μL) 0.2 μL，滅菌雙蒸水加至25 μL。

PCR反應條件：nuc基因94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，28個循環(huán)；72℃延伸5 min。fexA基因94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增結果經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 pET-fexA質粒的構建及基因工程菌pET-fexA/BL21耐藥性檢測 參照pET-32(a)載體說明書進行連接，將目的基因與pET-32(a)載體經SacⅠ、BamHⅠ雙酶切后，用T4連接酶進行連接。經42℃熱激法轉入JM109中，37℃培養(yǎng)12 h～16 h，選擇白色菌落經酶切和PCR兩種方法鑒定出陽性菌，送測序公司進行測序。pET-fexA質粒成功構建后，提取質粒，經42℃熱激法轉入BL21中，選取氨芐陽性菌株進行培養(yǎng)，經氟苯尼考和氯霉素進行耐藥誘導后，通過最小抑菌濃度試驗檢測其對氟苯尼考和氯霉素的敏感性。

1.2.5 分離菌最低抑菌濃度(MIC)測定 采用二倍瓊脂稀釋法，參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的方法進行操作[12]，并參照其標準判定結果。CLSI沒有規(guī)定金黃色葡萄球菌對氟苯尼考的耐藥臨界值，參考文獻報道把MIC≥16 mg/L的葡萄球菌歸為耐藥菌[13]。金黃葡萄球菌CVCC3055為藥物敏感性測定質控菌。

2 結果

2.1 病原菌分離與純化結果

葡萄球菌在甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基瓊脂平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤的菌落，顏色呈金黃色或淡紅色，邊緣常為淡色。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色或白色菌落，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，在菌落周圍形成溶血環(huán)，培養(yǎng)至72 h整個菌落均變?yōu)榻瘘S色。

2.2 病原菌的形態(tài)學及生化鑒定結果

革蘭染色結果顯示為革蘭陽性球菌，經顯微鏡觀察成葡萄串狀。經生化鑒定儀鑒定結果為金黃色葡萄球菌。

2.3 fexA基因的PCR擴增以及攜帶fexA基因陽性菌株的鑒定

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示(圖1和圖2)以質粒DNA為模板的PCR分別擴增出了1 446 bp特異性目的條帶，與預期片段大小相符；而以基因組DNA為模板的PCR未擴增出該目的片段，對照的質控菌均未擴增出目的條帶。以基因組DNA為模板檢測nuc基因的特異性，分別擴增出了480 bp目的條帶，與預期片段大小一致。DNA測序結果經BLAST分析，與GenBank上序列同源性90%以上，在分子水平上證明了是金黃色葡萄球菌的耐藥菌。

M.DNA標準DL 2 000；1～2.分離株質粒DNA的PCR產物；3～4.分離株基因組DNA的PCR產物；5.質控菌質粒DNA的PCR產物；6.質控菌基因組DNA的PCR產物

M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR products of plasmid DNA of isolates；3-4.PCR products of genomic DNA of isolates； 5.PCR products of plasmid DNA of control strain； 6.PCR products of genomic DNA of control strain

圖1fexA基因PCR擴增結果

Fig.1 PCR amplification result offexAgene

M.DNA標準DL 2 000；1～2.分離株；3.對照株

M.DNA Marker DL 2 000 ；1-2.Isolates；3.Control strain

圖2nuc基因PCR擴增結果

Fig.2 PCR amplification result of the nuc gene

2.4 pET-fexA質粒的鑒定

fexA基因的PCR純化產物與pET-32(a)載體連接后，經藍白斑篩選陽性克隆，經PCR檢測，擴增出的DNA片段大小與目的片段大小一致，說明重組質粒含有目的基因(圖3)。對重組質粒進行酶切鑒定，得到了約5 900 bp和1 446 bp 的兩條特異條帶，說明重組質粒含有目的基因。與測序結果相符，表明原核表達質粒pET-fexA構建成功。

M.DNA標準DL 2 000；1.重組質粒pET-fexA的酶切產物；2.重組質粒pET-fexA的PCR產物

M.DNA Marker DL 2 000； 1.Enzymatic digestion products of the recombinant isolates pET-fexA； 2.PCR products of the recombinant isolates pET-fexA

圖3重組質粒pET-fexA的PCR和酶切鑒定

Fig.3 Enzyme digestion identification and PCR amplification of pET-fexAplasmid

2.5 最低抑菌濃度(MIC)測定結果

pET-fexA質粒被成功構建后，轉入基因工程菌E.coliBL21中，菌株命名為pET-fexA/BL21。pET-fexA/BL21和BL21以及fexA陽性金黃色葡萄球菌分離株和質控菌株分別經0.5 μg/mL終濃度的氟苯尼考和氯霉素溶液進行誘導，其對氟苯尼考和氯霉素的敏感性結果見表1，pET-fexA/BL21對氯霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著增強，fexA陽性金黃色葡萄球菌分離株對氯霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著高于質控菌株。

3 討論

在廣譜抗菌藥物長期、廣泛和不規(guī)則使用的巨大壓力下，細菌通過基因突變和自然選擇以及耐藥基因的水平傳播等途徑，使得細菌耐藥性越來越復雜和嚴重。染色體是細菌最穩(wěn)定的遺傳物質，遺傳信息可經由親代染色體DNA的復制直接傳遞給子代，當細菌長期處于抗菌藥物的壓力時，最終產生突變，導致細菌產生耐藥性，耐藥基因也可通過多種方式整合入細菌染色體，親代獲得的耐藥性狀能夠穩(wěn)定攜帶與遺傳，從而介導細菌耐藥性的垂直傳播；細菌的質粒是一類能夠獨立于染色體外的可以進行自主復制的遺傳單位，其在體外通過結合轉移等方式進入到其他細菌體內，將耐藥基因傳遞給其他同種甚至不同種屬的藥物敏感菌，完成了細菌耐藥性的水平傳播。雖然遺傳物質的突變在細菌耐藥中起著重要的作用，但是研究表明通過獲得耐藥基因而表現耐藥的方式更占主導。

表1 最低抑菌濃度(MIC)測定結果

注：Ff.氟苯尼考；Cm.氯霉素。

Note:Ff.Florfenicol；Cm.Chloramphenicol.

近年來，研究者相繼報道了動物源和人源葡萄球菌耐氟苯尼考fexA基因，研究顯示fexA基因多數位于質粒上，也有少數位于染色體上的報道。Kehrenberg C等[6]在302株氯霉素耐藥的葡萄球菌中發(fā)現了12株fexA陽性菌株，既有定位在質粒上的，也有定位在染色體上的。本研究中，從質粒中分離到fexA基因，說明位于質粒上的fexA基因介導了金黃色葡萄球菌氟苯尼考耐藥性的傳播。fexA基因的核苷酸序列分析表明，同源性非常高，這可能與其通過質粒進行水平傳播的方式有關。Kehrenberg C等[14-15]研究發(fā)現該基因是新型轉座子Tn558的一部分，該轉座子位于質粒pSCFS2中，這在一定程度上增加了fexA傳播的可能性。Kehrenberg C等通過側翼序列的分析，對12株fexA陽性菌株進行研究，多數菌株均可以檢測到完整的Tn558的結構存在。雖然該類型轉座子屬于非結合型轉座子，但由于攜帶fexA基因的轉座子存在于質粒中，說明fexA基因可通過質粒發(fā)生水平轉移，在不同種屬的細菌之間很容易傳播擴散，這樣動物源金黃色葡萄球菌的氟苯尼考耐藥性就有可能通過接觸、動物性食品加工等途徑傳播至人源金黃色葡萄球菌。

由于臨床上的耐藥菌株普遍攜帶多重耐藥基因，為了排除細菌中其他氟苯尼考耐藥基因或泵出蛋白對fexA基因貢獻細菌耐藥的影響，本試驗成功構建了一個基因背景清楚且對氟苯尼考耐藥的細菌模型，為fexA基因編碼的蛋白定位研究奠定了基礎。

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IsolationandIdentificationofStaphylococcusaureusfromDairyCattleandCloningofFlorfenicolResistanceGenefexA

ZHAO Su-jun1,2,CAO Ye1,2,XIE Jing1,2,YU Ji-feng1,2,LI Jiang-ling1,2, WANG Qiu-shi1,2,LIAO Dang-jin1,2

(1.SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu,Sichuan,610066,China; 2.AnimalBreedingandGeneticskeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu,Sichuan,610066,China)

A total of 9 florfenicol-resistantStaphylococcusaureusstrains from dairy cattle were isolated and identified from the 100 dairy farm environmental samples and festering tissue samples.Plasmid DNA and genomic DNA of the 9 isolates were extracted.PCR analysis of plasmid DNA and genomic DNA with primers specific for the florfenicol resistance genefexAdemonstrated that the 1446bp amplicon was specifically detected in plasmid DNA and none in genomic DNA.The amplified fragment offexAgene was cloned into pET-32(a) vector,and a positive plasmid was obtained and named plasmid pET-fexA.The recombinant plasmids were successfully transformed intoE.coliBL21.A significant resistance to florfenicol and chloramphenicol was found in this strain.At the same time,the results of antimicrobial resistance revealed that the resistances to florfenicol and chloramphenicol of the positiveStaphylococcusaureusisolates withfexAgene fragment were significantly higher than that of quality-control strain.The research showed that thefexAgene conferred cross-resistant to florfenicol and chloramphenicol.In this study,we successfully established a florfenicol-resistant bacterial model with a clear genetic background,it ruled out the influence of other drug-resistant genes and efflux protein in bacteria on thefexAgene conferring drug-resistant bacteria,which will provide a basis for determining the localization offexAprotein.

Staphylococcusaureus; florfenicol;fexAgene; dairy cattle

2017-03-10

四川省畜牧科學研究院基本科研業(yè)務專項(SASA2014A14)

趙素君(1977- )，女(滿族)，遼寧錦州人，副研究員，博士，主要從事分子遺傳學研究。*

S852.611

A

1007-5038(2017)12-0034-05