覃思楠，寶志鵬，阮文強(qiáng)，陳新諾，何 歡，岳 華,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.國家民族事務(wù)委員會青藏高原動物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊，四川成都 610041；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650212)

2016年-2017年四川省部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查

覃思楠1，寶志鵬3，阮文強(qiáng)1，陳新諾1，何 歡1，岳 華1,2，張 斌1,2*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.國家民族事務(wù)委員會青藏高原動物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊，四川成都 610041；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650212)

為了解近年來四川省豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行毒株的遺傳變異和分子流行病學(xué)情況，通過RT-PCR方法，對四川省各地疑似病料進(jìn)行PRRSV檢測，確定獲得陽性樣本基因型和對GP5基因遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,149份疑似病料中經(jīng)ORF7片段檢測33份為陽性，陽性率為22.15%(95% CI：15.8%～29.7%)；通過對NSP2片段的檢測，其中有9份為PRRSV高致病性毒株(HP-PRRSV)，5份為PRRSV經(jīng)典毒株，8份為PRRSV NADC-30樣毒株；通過對GP5基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列測定，得到11株部分的GP5基因序列數(shù)據(jù)，所獲序列與已報道對應(yīng)核苷酸序列同源性為60.4%～99.8%，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為74.3%～100%。結(jié)果表明,近兩年四川地區(qū)PRRSV主要流行毒株為HP-PRRSV，同時新的變異毒株NADC30的流行呈上升趨勢。四川地區(qū)乃至國內(nèi)各地區(qū)的PRRSV基因在逐漸變異，且毒株的流行趨勢在轉(zhuǎn)變，提示應(yīng)加強(qiáng)對PRRSV流行及變異的監(jiān)測。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；GP5；分子流行病學(xué)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱為“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病。臨床表現(xiàn)主要為母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及生長育肥各階段豬呼吸道癥狀[1-3]。1987年該病首次在美國報道，隨后在全世界流行，已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，含9個開放閱讀框(ORF)，分別編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白和7個結(jié)構(gòu)蛋白。ORF7基因編碼保守結(jié)構(gòu)蛋白，常常作為檢測的分子靶點；ORF5基因編碼GP5結(jié)構(gòu)蛋白，GP5蛋白是主要的囊膜糖基化蛋白，在抗病毒感染上起著重要的作用，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[4]，GP5蛋白是PRRSV中變異最為顯著的結(jié)構(gòu)蛋白，現(xiàn)在許多學(xué)者都把ORFS基因的變異情況作為一個分析病毒的遺傳演化規(guī)律的重要標(biāo)志[5]；Nsp2基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白是PRRSV中變異最大的區(qū)域，具有調(diào)節(jié)其他編碼非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域剪切的活性，是病毒復(fù)制的關(guān)鍵[6]。2006年，因在Nsp2上缺失30個氨基酸而變異的HP-PRRSV毒株在我國流行。據(jù)報道我國2013年四川地區(qū)也開始暴發(fā)了以HP-PRRSV毒株為主的PRRS，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。近年來，PRRSV新變異毒株不斷出現(xiàn)，尤其是傳入我國的NADC-30樣PRRSV新毒株，已經(jīng)在我國河南、河北、廣東、湖北和山西等地區(qū)流行[8-9]。本研究主要通過采集2016年-2017年四川省部分地區(qū)疑似PRRSV感染保育豬的肺、脾、淋巴結(jié)和血清等臨床樣本，利用RT-PCR方法研究四川地區(qū)PRRSV流行株GP5基因變異情況和發(fā)展趨勢，對四川地區(qū)PRRSV進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，為更好地控制該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 Trizol試劑、氯仿、異丙醇、750 mL/LDEPC水-乙醇、ddH2O均由本實驗室提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T Vector、MarkerⅡ為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；QuickTaqHS DyeMix為東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑和膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α購自北京天根生化科技有限公司；高速離心機(jī)5804購自Eppendor公司;普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)Versa Doc 2 000均購自Bio-Rad公司。

1.1.2 引物 參照文獻(xiàn)[9]中引物序列合成針對ORF7基因的特異性引物，參考文獻(xiàn)[11]中引物序列合成針對GP5基因的特異性引物，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計針對PRRSV的Nsp2基因使用可以區(qū)分經(jīng)典株、高致病性變異株和NADC30樣毒株的特異性引物，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 采集四川省綿陽、邛崍、崇州、北川、大邑等地不同地區(qū)31個豬場共141份疑似PRRSV陽性患病保育豬的血清、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織器官。置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 RNA的提取 將采集的少量豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)剪碎和血清取400 μL加入1.5 mL管中，加700 μL Trizol劇烈混勻，室溫靜止5 min。加入200 μL氯仿，顛倒混合，在渦旋儀上劇烈混勻，使液體呈乳白色(無分層現(xiàn)象)室溫靜止5 min，放到離心機(jī)以1 200 r/min 4℃離心15 min。將離心后的上清液移至新EP管中加入等體積(400 μL)異丙醇，上下來回顛倒，室溫靜止10 min，放到離心機(jī)以1 200 r/min 4℃離心15 min。倒掉上清液，加入1 mL 750 mL/L的DEPC水乙醇，洗滌RNA沉淀及壁管，彈起沉淀物再渦旋，放到離心機(jī)以1 200 r/min 4℃離心10 min。棄上清液，對EP管進(jìn)行干燥。最后用15 μL～20 μL DEPC水將RNA溶解，置-20℃保存。

1.2.3 cDNA的合成 以20 μL體系反轉(zhuǎn)錄：RNA模板4 μL，5×Prime Script buffer 4 μL，Prime ScriptRT Enzyme Mix 1 μL，Random 6 mers 2 μL，RNase free dH2O 9 μL。反應(yīng)條件為：37℃ 15 min；85℃ 15 s，16℃ 10 min得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。

1.2.4 陽性病料的篩選 以cDNA為模板，用PRRSV的保守ORF7基因序列設(shè)計的檢測引物(表3)對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL:模板cDNA 1 μL，QuickTaqHS Dye Mix 5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 3 μL。ORF7 F/R引物反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，68℃ 40 s，35個循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，篩選出陽性樣本。

1.2.5 Nsp2基因和GP5基因的PCR擴(kuò)增與克隆 利用Nsp2引物和GP5引物分別對PRRSV的陽性樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR按25 μL反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，QuickTaqHS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。Nsp2 F/R引物反應(yīng)條件： 94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，68℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 8 min。GP5 F/R引物反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，68℃ 1 min ，共35個循環(huán)；72℃延伸8 min。得到的PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，再一次篩選陽性樣本，根據(jù)用Nsp2引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物跑的電泳條帶區(qū)分經(jīng)典毒株、變異株及NADC30樣毒株。并將這兩種引物擴(kuò)增的陽性樣本，PCR產(chǎn)物純化試劑盒或膠回收試劑盒切膠回收純化后與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.6 GP5基因遺傳變異分析 應(yīng)用DNA Star 7.1中的Meg Align對不同毒株的GP5基因進(jìn)行序列比對和同源性分析，并用MEGA 5.2繪制出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 ORF7基因擴(kuò)增結(jié)果

對2016年-2017年從四川各地采集的149份PRRSV疑似病料提取RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增PRRSV的ORF7基因，結(jié)果獲得與預(yù)期片段大小相等的特異性片段，ORF7片段大小為561 bp，檢出陽性樣本33份，陽性率為22.15%(95% CI：15.8%～29.7%)。

2.2 Nsp2基因的檢出結(jié)果

對33份陽性樣本的Nsp2基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得5份經(jīng)典毒株P(guān)RRSV Nsp2片段大小為887 bp(圖1)，檢出率為15.2%(95% CI：5.1%～31.9%)；9份高致病性變異株P(guān)RRSV Nsp2片段大小為797 bp(圖1)，檢出率為27.3%(95% CI：13.3%～45.5%)；8份NADC30樣毒株P(guān)RRSV Nsp2片段大小為493 bp(圖1)，檢出率為24.2%(95% CI：11.1%～42.3%)。

2.3 GP5基因序列的擴(kuò)增和測定

通過對33份陽性樣本的GP5基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及序列的測定，結(jié)果獲得11份與目的片段大小相同的特異性片段，GP5片段大小為864 bp。

2.4 GP5基因結(jié)果分析

獲得的11株P(guān)RRSV GP5基因(GenBank號：KY806209-KY806219)與NCBI基因庫中參考序列對應(yīng)核苷酸序列同源性為60.4%～99.8%之間，氨基酸序列同源性為74.3%～100%之間。與PRRSV美洲型代表毒株的核苷酸序列同源性62.4%～99.4%，氨基酸序列同源性為77.3%～100%，與中國經(jīng)典毒株CH-1a的核苷酸序列同源性65.3%～95.6%，氨基酸序列同源性為80.2%～97.6%。與高致病性毒株P(guān)RRSV JAX1美洲毒株和NADC30的核苷酸序列同源性分別為67.5%～99.0%和61.9%～95.7%，氨基酸序列同源性分別為81.6%～99.3%和76.4%～98.3%。通過用MEGA 5.2軟件構(gòu)建所得毒株與參考毒株的核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，得到3株HP-PRRSV毒株，3株NADC30樣毒株，5株經(jīng)典毒株。亞群Ⅰ中的試驗毒株各為一小支，并處在變異毒株JXA1和中國經(jīng)典CH-1a毒株之間，可看出這3個毒株是由中國內(nèi)地的經(jīng)典毒株向變異毒株轉(zhuǎn)變的。處于亞群Ⅱ里的2個試驗毒株聚為一支，與NADC30樣毒株距離較近，有一個毒株與北美毒株HNyc15為一支，與NADC30樣毒株相比有一定程度的變異。在亞群Ⅲ中4個試驗毒株聚為一支，與北美經(jīng)典毒株VR2332存在一定差異。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；N.陰性對照；1～10.樣本 M.DNA Marker DL 2 000；N.Negative control；1-10.Samples

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；P.陽性對照；N.陰性對照；1～6.樣本 M.DNA Marker DL 2 000；P.Positive control；N.Negative control；1-6.Samples

3 討論

20世紀(jì)80年代末PRRS首次在中國被發(fā)現(xiàn)，是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一。由于該病毒具有遺傳多樣性，導(dǎo)致了造成全球豬養(yǎng)殖大國的經(jīng)濟(jì)損失[12]。本研究針對2016年-2017年四川部分地區(qū)疑似PRRSV感染病料，通過RT-PCR進(jìn)行ORF7、Nsp2和GP5基因的檢測及對GP5基因序列的遺傳進(jìn)化分析。經(jīng)RT-PCR對ORF7基因的檢測得到33份陽性樣本；對Nsp2基因的檢測得到21份，其余12份陽性樣本未檢出，分析12份樣本的Nsp2基因可能發(fā)生了變異，用特異性引物未能檢出；對GP5基因的檢測與序列測定，獲得11株病毒序列，說明四川部分地區(qū)的PRRSV病毒變異性較大。

研究表明，Nsp2為PRRSV基因組中變異最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，Nsp2的變異主要表現(xiàn)為核苷酸的缺失和插入。Shen S[13]于2000年首次報道與VR-2332毒株相比，PRRSV北美洲型SP株813～814處插入了36個氨基酸。Choi H W等[12]研究韓國PRRSV分離株NSP2存在392和393個核苷酸的缺失。常用Nsp2作為監(jiān)測PRRSV變異的獨特標(biāo)記，用于對PRRSV進(jìn)行分子流行病學(xué)分析[14]。由Nsp2基因的檢測可得知，四川部分地區(qū)流行的PRRSV仍以HP-PRRSV為主，經(jīng)典毒株同時存在，而新發(fā)現(xiàn)的NADC30變異毒株的流行呈上升趨勢，這些新毒株的流行很有可能與引種有關(guān)[15-16]，但這還需進(jìn)一步證實。

圖3 基于GP5基因推導(dǎo)的核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹

近年來，全球依據(jù)PRRSV的抗原特性將其分為2種基因型，分別是以VR2332毒株為代表的美洲型和以LV毒株為代表的歐洲型。ORF5基因編碼的GP5結(jié)構(gòu)蛋白在PRRSV中突變率最大，GP5蛋白不僅具有很強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生主要抗原，GP5基因已成為分析PRRRSV遺傳變異情況的靶基因。有研究表明四川地區(qū)的PRRSV流行毒株在GP5基因上的變異區(qū)域較大[16]，GP5蛋白上的氨基酸易變異，使病毒逃避機(jī)體的體液免疫。通過分析GP5基因序列，11株P(guān)RRSV GP5基因與國內(nèi)外參考序列對應(yīng)核苷酸序列同源性為60.4%～99.8%之間，推導(dǎo)氨基酸序列同源性74.3%～100%之間，且所獲得的PRRSV毒株均屬于美洲型毒株。這表明四川部分地區(qū)PRRSV流行毒株與標(biāo)準(zhǔn)毒株在GP5基因區(qū)域的變異比較大。在GP5基因的進(jìn)化樹中，有3株位于基因進(jìn)化樹中亞群Ⅰ，與中國流行PRRSV變異毒株JXA1、WUH4高度同源，這些流行毒株很有可能由HP-PRRSV演化而來；有3株位于基因進(jìn)化樹中亞群Ⅱ，與美國毒株NADC30、HNyc15高度同源，這種新毒株的出現(xiàn)和流行與引種和跨地區(qū)傳播有很大的聯(lián)系；有5株在基因進(jìn)化樹中位于經(jīng)典毒株VR2332、BJ4為代表的亞群Ⅲ中，提示四川省部分地區(qū)的經(jīng)典PRRSV至今還在不斷的進(jìn)化重組中。近幾年發(fā)現(xiàn)的新變異毒株NADC30，表明了PRRSV流行毒株的變異和多樣性。由于PRRSV在不斷的變異和進(jìn)化，使得對其的臨床診斷、實驗室診斷和疫苗防控造成了一定的困難，應(yīng)實時監(jiān)測分析PRRSV的流行情況和遺傳進(jìn)化，為防控該病提供重要的參考依據(jù)。

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MolecularEpidemiologicalInvestigationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinSichuanProvincefrom2016to2017

QIN Si-nan1,BAO Zhi-peng3,RUAN Wen-qiang1,CHEN Xin-ruo1, HE Huan1,YUE Hua1,2,ZHANG Bin1,2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,SuothwestMinzuUniversity,Chengdu，Sichuan,610041,China; 2.AnimalDiseasePreventionandControlInnovationTeamintheQinghaiTibetPlateauofStateEthnicAffairsCommission,Chengdu,Sichuan, 610041,China; 3.YunnanVocationalandTechnicalCollegeofAgriculture,Kunming,Yunnan,650212,China)

In order to investigate the genetic variation and molecular epidemics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Sichuan province during 2016 to 2017,149 PRRSV-suspected samples were collected from in different regions of Sichuan province and were detected by RT-PCR.The PRRSV-positive samples were used to identify the genotypes and genetic analysis of GP5 gene.The result showed that the 33 out of 149 samples was identified as the PRRSV targeting the ORF7 gene,and the positive rate was 22.15% (95% CI：15.8%-29.7%).By targeting NSP2 gene,the 33 PRRSV-positive samples was identified as 9 of highly pathogenic strains(HP-PRRSV),5 of PRRSV classical strains and 8 of PRRSV NADC-30 like strains.The partial of GP5 genes were amplified and sequenced from 11 samples.The nucleic acid / deduced amino acid sequences shared 60.4%-99.8%/74.3%-100% similarities to each other.The study indicated that HP-PRRSV was predominant genotype and the prevalence of novel NADC30 like strains was obviously increased in Sichuan regions for last two years.Therefore,the study suggested that the monitoring of prevalence and mutant in PRRSV should been further strengthened.

PRRSV; GP5; molecular epidemiology

2017-05-10

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0500705);西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(CX2017SZ052)

覃思楠(1993-)，女(布依族)，貴州獨山人，碩士研究生，主要從事動物病原分子生物學(xué)研究。*

S852.659.6

A

1007-5038(2017)12-0029-05