于林洋，董建國,2，張樂宜，劉燕玲，梁鵬帥，王 磊，宋長緒*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2.信陽農(nóng)林學院牧醫(yī)工程學院，河南信陽 464000)

2016年-2017年廣東省部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因的遺傳變異分析

于林洋1，董建國1,2，張樂宜1，劉燕玲1，梁鵬帥1，王 磊1，宋長緒1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2.信陽農(nóng)林學院牧醫(yī)工程學院，河南信陽 464000)

為研究廣東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遺傳演化情況，采用RT-PCR方法對2016年-2017年采自廣東省地區(qū)豬場疑似PRRS豬肺臟組織樣品中的PRRSV ORF5基因進行了擴增，并對這些毒株的核苷酸和氨基酸序列進行了生物信息學分析。結(jié)果表明,成功擴增出12株P(guān)RRSV流行毒株的ORF5基因片段。遺傳演化分析表明,擴增出的毒株有10株與國內(nèi)高致病性毒株親緣關(guān)系較近，屬于同一分支；2株與廣東地區(qū)新報道的毒株QYYZ和GM2親緣關(guān)系較近，屬于同一分支。氨基酸序列比對結(jié)果表明，新分離的毒株在GP5抗原表位上存在廣泛的變異。結(jié)果表明，該地區(qū)PRRSV毒株已經(jīng)發(fā)生廣泛變異。研究結(jié)果不僅揭示了廣東地區(qū)流行的PRRSV ORF5基因的遺傳演化特性，也為該地區(qū)PRRS的防控提供了科學依據(jù)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF5 基因；變異分析

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是以引起母豬流產(chǎn)、弱胎和木乃伊胎為主的繁殖障礙性疾病和以各種年齡豬呼吸系統(tǒng)疾病為特征的一種重大傳染病[1]。該病20世紀80年代首次報道，隨后短短幾十年間，該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給世界養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。

PRRS的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，1991年在新西蘭首次證實引起PRRS的病原是PRRSV，隨后1992年美國也證實[3-5]。PRRSV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬成員[6]。PRRSV全長大約15 kb，包含至少10個開放閱讀框(ORF)：ORF1a，ORF1b，ORF2a，ORF2b，ORFs3-7以及最近發(fā)現(xiàn)的ORF5a[7]。ORF1a和ORF1b位于5′ UTR的下游，編碼復(fù)制酶多聚蛋白pp1a和pp1b，pp1a和pp1b進一步水解成非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP)NSP1α，NSP 1β，NSP 2～NSP 6，NSP 7α和NSP 7β，NSP 8 ～ NSP 12[8]。ORF2a，ORF2b，ORFs3-7位于基因組的3′端，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2，E，GP3，GP4，GP5，GP5a，M,N[9]。

根據(jù)基因組的差異性，PRRSV被分為兩個基因型：以Lelystad virus為代表毒株的歐洲型PRRSV(1型)和以VR-2332為代表的北美型PRRSV(2型)。令人驚訝的是，PRRSV在兩個大陸上似乎經(jīng)歷了不同的進化。這兩種類型的毒株核苷酸同源性僅有60%左右，但是能夠引起相似的癥狀[10]。PRRSV RNA聚合酶易于出錯的特性和PRRSV不斷地重組以及外界選擇壓力的共同作用，導致該病毒快速發(fā)生變異[11-12]。在所有基因中，NSP2區(qū)域和GP5基因是變異最大的區(qū)域，研究者經(jīng)常選擇NSP2和GP5基因進行PRRSV遺傳演化分析[13]。

1995年中國首次證實有PRRS的存在，隨后疾病迅速蔓延至中國大部分地區(qū)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2006年，中國暴發(fā)了以持續(xù)高熱、皮膚發(fā)紅、高發(fā)病率和高病死率為特征的非典型性PRRS。該病迅速傳遍全國，對中國養(yǎng)豬業(yè)造成了史無前例的打擊。進一步研究證實該病是由NSP2區(qū)域存在30個不連續(xù)氨基酸的缺失為特征的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起[14-15]。2014年，中國多地區(qū)報道NADC30-like毒株流行，致使現(xiàn)在市面上的商品化疫苗效果較差，給我國PRRS防控帶來了巨大困難[16-19]。

本研究對2016年-2017年來自廣東地區(qū)的可疑PRRSV豬肺臟病變組織進行病毒RNA/DNA的提取，并進行PRRSV ORF5的RT-PCR擴增。選取陽性PCR產(chǎn)物進行基因序列分析。同時選取國內(nèi)外具有代表性的PRRSV毒株與所測定的基因序列進行遺傳進化分析。根據(jù)分析結(jié)果得出廣東省PRRSV的遺傳進化趨勢，為廣東省內(nèi)PRRSV防控提供有力的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 樣品來自廣東省疑似暴發(fā)PRRS的自然發(fā)病豬場，采集發(fā)病豬肺臟組織于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細胞、菌體及載體 本試驗所使用Marc-145細胞，克隆宿主菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞以及陽性對照病毒株GDzj株均由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院豬病防控研究室保存；pMD-19T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒為Magen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；RT-PCR相關(guān)試劑盒為Toyobo生物科技有限公司和Vazyme公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000等為TaKaRa公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；EB替代染料為廣州華奇盛生物科技有限公司產(chǎn)品；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和Trans-5α感受態(tài)細胞均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)布的VR-2332等PRRSV毒株全基因組序列進行生物信息學分析，選取保守區(qū)域設(shè)計1對特異性引物用于擴增ORF5基因序列。GP5-F：5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3；GP5-R：5′- CATTATTGGCGTGTAGGTGATAGAAAA-3′，擴增大小為821 bp。引物由蘇州金維智生物公司合成。

1.2.2 ORF5基因的擴增及克隆 取0.5 g左右的肺臟組織剪碎置于無菌勻漿器中，加入1 mL滅菌PBS，于冰浴中勻漿處理后轉(zhuǎn)移至1.5 m LEP管中，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清置于一新的1.5 mL EP管中。按TRIzol試劑盒操作說明書提取病料組織總RNA。以提取的總RNA為模板，采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進行RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。然后以cDNA為模板，GP5-F/GP5-R為引物，使用TOYOBO生物科技有限公司高保真酶對目的片段進行擴增。擴增體系為50 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，10×PCR buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，cDNA模板4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，RNase Free H2O 28 μL。PCR擴增循環(huán)參數(shù)為：94℃ 2 min；98℃ 10 s，62℃ 30 s，68℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳的觀察。PCR陽性樣品用凝膠回收后克隆于pEASY-Simple T1 Cloning Vector載體上，陽性重組質(zhì)粒由蘇州金維智生物公司測序。

1.2.3 序列比對與分析 利用Lasergene及Mega 5.0軟件將對不同病毒株的ORF5基因序列進行序列比對并構(gòu)建進化樹，同時將GP5氨基酸序列與其他國內(nèi)外代表毒株的GP5氨基酸序列進行比對分析。PRRSV代表毒株的基因序列均下載自GenBank。

2 結(jié)果

2.1 ORF5 基因的 RT- PCR 擴增結(jié)果

用特異性擴增PRRSV ORF5基因序列的引物對采集的20份疑似 PRRS 病料樣品進行RT-PCR 擴增，圖1結(jié)果顯示，12份病料樣品為陽性，編號分別為GDzj，GDkp，GDqy，GDjy，GDmz，GDsg，GDyf，GDgz，GDmm，GDhy，GDhf，GDhz。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與預(yù)期相符。

M.DNA標準DL 2 000；1～12.GDzj，GDkp，GDqy，GDjy，GDmz，GDsg，GDyf，GDgz，GDmm，GDhy，GDhf，GDhz；13.陽性對照；14.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1- 12.GDzj，GDkp，GDqy，GDjy，GDmz，GDsg，GDyf，GDgz，GDmm，GDhy，GDhf，GDhz；13.Positive control；14.Negative control

圖1疑似PRRS病料樣品ORF5基因RT-PCR擴增結(jié)果

Fig.1 RT-PCR amplication of PRRS ORF5 gene in samples

2.2 ORF5基因核酸遺傳進化分析

對擴增得到的12份陽性樣品的PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果顯示均獲得了預(yù)期大小的目的片段。為了進一步分析這些毒株間的遺傳演化情況，運用分子生物學軟件對分離毒株和其他國內(nèi)外具有代表性的毒株進行進化樹的構(gòu)建(圖2)，結(jié)果顯示,整個遺傳進化樹可分為兩大支：以Lelystad virus為代表的歐洲型分支和以VR2332為代表的北美型分支，以VR-2332為代表的北美型分支又可進一步分為以GM2和QYYZ為代表的subgroup 1，以美國經(jīng)典毒株VR-2332為代表的subgroup 2，以NADC30為代表的subgroup 3，以中國經(jīng)典毒株CH-1a為代表的subgrouup 4，以中國高致病性毒株HuN4、JXA1和JXwn06為代表的subgroup 5。其中GDhf和GDhz屬于subgroup 1，GDhy屬于subgrouup 4，其余毒株屬于subgrouup 5。

圖2 PRRSV ORF5基因遺傳進化分析

2.3 ORF5基因同源性分析

用DNAStar軟件進行分離毒株P(guān)RRSV ORF5基因同源性分析(圖3)，結(jié)果顯示，分離毒株之間的同源性在90.6%～95%，分離毒株與美洲型代表株VR-2332同源性在83.1%～89.4%，與Ch-1a同源性在83.9%～95.9%，與HUN4和JXA1同源性在83,6%～99.8%，與NADC30同源性在84.4%～86.4%，與QYYZ同源性在82.6%～93.2%。其中GDhf和GDhz與QYYZ同源性最高，在91.0%～93.2%，其余毒株與HUN4和JXA1同源性最高，為96.2%～99.8%。這些毒株與歐洲型Lelystad virus同源性僅為62.9%～64.0%。

2.4 PRRSV GP5氨基酸序列比對

目前已經(jīng)確定的北美型毒株GP5蛋白上有3個表位，1個為中和表位(aa37-45),2個非中和表位(aa27-30和aa180-197)。除此之外，GP5上還有2個重要的抗原相關(guān)區(qū)域，1個是胞外區(qū)域(aa27-41)，1個是C末端區(qū)域(aa180-197)。如圖4所示，與北美型毒株VR-2332相比，所獲得的12個廣東毒株，在中和表位(aa37-45)，僅有1個毒株GDmz存在G38A的突變。在非中和表位區(qū)域aa27-30，有4個毒株GDsg，GDyg，GDgz，GDmm在29位由G突變?yōu)锳，GDhf和GDhz由G突變?yōu)門。在非中和表位aa180-197，除GDhf和GDhz外，其他10株有T183C和G197C突變；不同于其他10株，GDhf和GDhz存在G195A和A196T突變，與QYYZ突變一樣；除此之外，GDhf還存在A189G的突變。

3 討論

自從中國分離第1株P(guān)RRSV CH-1a以來，PRRS已經(jīng)變成了養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[14-15]。由于PRRSV造成的免疫抑制和宿主的免疫系統(tǒng)選擇壓力的影響，病毒很難徹底被宿主清除，病毒基因組不斷發(fā)生突變導致新的突變毒株越來越多[11-12]。

圖3 PRRSV ORF5基因同源性分析

圖4 PRRSV GP5蛋白氨基酸比對分析

從廣東省各個地區(qū)發(fā)病豬場采集病料鑒定測序，得到12個病毒株的ORF5基因序列。從ORF5進化分析可以看出，這12個毒株屬于兩個不同的亞群，GDhf和GDhz與近些年廣東地區(qū)分離的變異毒株GM2和QYYZ同源性最近，屬于同一分支，其他毒株與中國2006年出現(xiàn)的HP-PRRSV毒株同源性最高，屬于同一分支。有報道顯示近些年NADC30-like毒株在中國廣泛流行，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[16-19]。檢測結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)NADC30-like毒株。這些結(jié)果表明廣東地區(qū)廣泛流行HP-PRRSV毒株和新的與NADC30不同的變異毒株。

PRRSV GP5蛋白為囊膜糖蛋白，是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有較高的免疫原性和中和活性[20]。有研究證實PRRSV上有3個抗原表位，其中在氨基酸37-45位(aa37-45)為中和表位；在氨基酸27-30位(aa27-30)和氨基酸180-197(aa180-197)位是2個非中和表位[21]。將測得的ORF5毒株序列與國內(nèi)外代表毒株相比，在獲得的12個毒株中，僅有GDmz在中和表位(aa37-45)區(qū)域存在G38A突變。突變較大的是非中和表位，有4個毒株在aa27-30區(qū)域G29A突變，2個毒株存在G29T突變；有10個毒株在aa180-197區(qū)域存在T183C和G197C的突變，另外兩個毒株GDhf和GDhz同源性與最近廣東地區(qū)新分離的毒株QYYZ同源性最高，不同于其他毒株，這2個毒株在非中和表位aa180-197區(qū)域G195A和A196T。這些位點的突變很可能影響GP5蛋白的免疫原性，導致疫苗免疫效價降低，影響疫苗的免疫特性，致使豬場的免疫失敗。

目前中國廣大地區(qū)均有NADC30-like毒株不斷出現(xiàn)的報道，有研究者證實我國的NADC30-like毒株是由中國高致病性毒株和NADC30樣毒株間重組產(chǎn)生的，具有高致病性[22]。也有研究者證實分離的NADC30-like毒株致病性較低[23]。這些結(jié)果表明PRRSV在我國發(fā)生了廣泛的變異。我們檢測的12株毒株中有2株與最近廣東分離的QYYZ毒株同源性最高，該毒株具有高致病性特點，但與高致病性毒株親緣關(guān)系較遠，是否分離的這兩株也具有高致病性有待于進一步研究證實[24]。另外，10株毒株與國內(nèi)高致病性毒株親緣關(guān)系較近，屬于同一分支。我們的研究結(jié)果表明PRRSV仍在不斷變異，且不同地區(qū)分離的毒株存在較大的差異，這些結(jié)論有助于更全面地了解廣東地區(qū)PRRSV的流行特征，便于疾病的防控。

[1] Hopper S A,White M E C,Twiddy W.An outbreak of blue-eared pig disease (porcine reproductive and respiratory syndrome) in four pig herds in Great Britain [J].Vet Rec,1992,131(7):140-144.

[2] Keffaber K K.Reproductive failure of unknown etiology [J].Am Assoc Swine Pract Newsl，1989(1):1-9.

[3] Albina,E.Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS):an overview [J].Vet，Microbiol，1997,55:309-316.

[4] Keffaber K K.Reproductive failure of unknown etiology [J].Am Assoc Swine Vet,1989,1( 2)：1-9.

[5] Wensvoort G,Terpstra C,Pol J M,et al.Mystery swine disease in The Netherlands:the isolation of Lelystad virus [J].Vet Q，1991,13：121-130.

[6] Meulenberg J J,Hulst M M,de Meijer E J,et al.Lelystad virus,the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS),is related to LDV and EAV [J].Virology，1993,192：62-72.

[7] Johnson C R,Griggs T F,Gnanandarajah J,et al.Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by an alternative ORF5 present in all arteriviruses [J].J Gen Virol，2011,92：1107-1116.

[8] Beerens N,Selisko B,Ricagno S,et al.De novo initiation of RNA synthesis by the arterivirus RNA-dependent RNA polymerase [J].J Virol，2007,81：8384-8395.

[9] Johnson C R,Griggs T F,Gnanandarajah J,et al.Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by an alternative ORF5 present in all arteriviruses [J].J Gen Virol，2011,92：1107-1116.

[10] Forsberg R.Divergence time of porcine reproductive and respiratory syndrome virus subtypes [J].Mol Biol Evol，2005,22：2131-2134.

[11] Li Y,Wang X,Bo K,et al.Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern region of China [J].Vet J，2007,174：577-584.

[12] Yuan S,Nelsen C J,Murtaugh M P,et al.Recombination between North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J].Virus Res，1999,61：87-98.

[13] Cha S H,Chang C C,Yoon K J.Instability of the restriction fragment length polymorphism pattern of open reading frame 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus during sequential pig-to-pig passages [J].J Clin Microbiol，2004，42：4462-4467.

[14] Li Y,Zhou L,Zhang J,et al.Nsp9 and Nsp10 contribute to the fatal virulence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China [J].PLoS Pathog，2014,10：e1004216.

[15] Nelsen C J,Murtaugh M P，F(xiàn)aaberg K S.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison:divergent evolution on two continents [J].J Virol，1999,73：270-280.

[16] Li X,Bao H,Wang Y,et al.Widespread of NADC30-like PRRSV in China:Another Pandora's box for Chinese pig industry as the outbreak of highly pathogenic PRRSV in 2006 [J].Infect Genet Evol，2017,49:12-13.

[17] Zhang Q,Jiang P,Song Z,et al.Pathogenicity and antigenicity of a novel NADC30-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China [J].Vet Microbiol，2016,197:93-101.

[18] Li X,Wu J,Tan F,et al.Genome characterization of two NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China [J].Springerplus，2016,5(1):1677.

[19] Sun Z,Wang J,Bai X,et al.Pathogenicity comparison between highly pathogenic and NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J].Arch Virol，2016，161(8):2257-2261.

[20] Zhang Q Y,Xu X J,You S M,et al.Emerging of two new subgenotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in Southeast China [J].Microb Pathog,2016; 97:27-33.

[21] Kijona F K,Gholamreza H,Denis K G,et al.Genetic variation and phylogentic analyses of the ORF5 gene of acute porcine respiratory and reproductive syndrome viruse isolate [J].Vet Microbiol,2001,83(3):249-263.

[22] 郭天準，常洪濤，崔丹丹，等.2014-2015 年河南地區(qū)PRRSV 的分子檢測及 NSP2、ORF5 基因變異分析 [J].病毒學報，2016，32(3)：298-307.

[23] Plagemann P G.GP5 ectodomain epitope of porcin reproductiveand respiratory syndromevirus,strain Lelystad virus [J].Virus Res,2004,102(2):225-230.

[24] Lu W H,Tun H M,Sun B L,et al.Re-emerging of porcine respiratory and reproductive syndrome virus (lineage 3) and increased pathogenicity after genomic recombination with vaccine variant [J].Vet Microbiol,2015,175:332-340.

GeneticVariationsofORF5GenesofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeIsolatedinGuangdongRegionsfrom2016to2017

YU Lin-yang1,DONG Jian-guo1,2,ZHANG Le-yi1,LIU Yan-ling1,LIANG Peng-shuai1, WANG Lei1,SONG Chang-xu1

(1.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgricultureUniversity,Guangzhou，Guangdong,510642,China; 2.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary,XinyangCollegeofAgricultureandForestry,Xinyang,Henan,464000,China)

To investigate the genetic variations of ORF5 genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolated in Guangdong regions,the lung samples of pigs suspected to be PRRSV positive from pig farms in Guangdong during 2016 to 2017 were collected and the ORF5 of the PRRSV in these samples were amplified by RT-PCR.The ORF5 gene sequences and deduced amino acid sequences were furtherly analyzed.Twelve complete ORF5 gene sequences were amplified,and phylogenetic analysis results showed that 10 isolates had close genetic relationship with the highly pathogenicitic PRRSV (HP-PRRSV) strains and they belonged to the same cluster.Other 2 isolates had close genetic relationship with the newly isolated strain QYYZ and they belonged to the same cluster.The amino acids alignment results indicated that the epitope of GP5 had extensive amino acid mutations.These results indicated that the region's PRRSV strains have experienced extensive evolation.These results not only revealed that the genetic evolution characteristics of PRRSV ORF5 gene in Guangdong,but also provided a scientific basis for furtherly controlling the PRRS.

Porcine reproductive and respiratory syndrome; ORF5 gene; variation analysis

2017-04-27

國家支撐計劃項目(2015BAD12B02-5)； 廣州市科技計劃項目(201508020062)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)創(chuàng)新團隊項目(2016LM2150)

于林洋(1992-)，男，河南駐馬店人，碩士，主要從事動物分子病毒學和免疫學研究。*

S82.659.6

A

1007-5038(2017)12-0023-06