張 曼，韓 飛

(陜西省楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院，陜西楊凌 712100)

A型副雞嗜血桿菌血凝素基因原核表達及間接ELISA方法的建立及應(yīng)用

張 曼，韓 飛

(陜西省楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院，陜西楊凌 712100)

原核表達A型副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarumserotype A，Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA，并以HA蛋白為包被抗原，建立血清間接ELISA檢測方法。克隆HpgHA基因，將其克隆至原核表達載體pET-28a(+)中進行重組HA蛋白的誘導(dǎo)表達，對表達產(chǎn)物進行純化，并進行Western blot鑒定；用純化后的HA蛋白作為包被抗原，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立血清間接ELISA檢測方法，并進行特異性、靈敏度和重復(fù)性試驗，最后對臨床樣品進行檢測。原核表達獲得大小約為37 ku的重組HA蛋白；Western blot結(jié)果表明重組蛋白具有良好的特異性和抗原反應(yīng)性。Hpg間接ELISA優(yōu)化反應(yīng)條件為：抗原包被量每孔500 ng，血清以1∶200倍稀釋作用1 h，酶標(biāo)二抗以1∶2 500倍稀釋作用1 h，TMB顯色時間為10 min。在該優(yōu)化條件下，OD450≥0.34為陽性，反之為陰性；特異性試驗結(jié)果表明對雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清檢測均為陰性；對85份陽性血清進行檢測，敏感性為98.8%；重復(fù)性試驗結(jié)果表明，批內(nèi)和批間OD450值的變異系數(shù)分別1.5%～3.7%和6.5%～8%。用本試驗建立的方法對臨床上215份雞血清樣品進行檢測，陽性率為25.1%。說明建立的ELISA檢測方法可用于Hpgserotype A抗體水平的檢測。

A型副雞嗜血桿菌；血凝素蛋白；純化；間接ELISA

副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)是雞傳染性鼻炎的病原，該病臨床癥狀為雞的急性上呼吸道感染，鼻腔和鼻竇發(fā)炎，眼結(jié)膜發(fā)炎，流淚，病雞產(chǎn)蛋量下降，生長緩慢[1]。本病潛伏期短，傳播快，發(fā)病率高，病死率低[1-2]，在世界各地均有流行，給雞的養(yǎng)殖造成很大的經(jīng)濟損失[2-4]。Hpg分為A、B、C 3個血清型[5]。雞傳染性鼻炎近年來在我國呈蔓延之勢，A型和B型的Hpg已在我國部分地區(qū)長期流行[6-7]。感染的雞場很難清除該病，對于該病主要以藥物和疫苗進行預(yù)防。免疫水平檢測可以反映雞群感染狀態(tài)或免疫狀態(tài)，為本病的防治提供依據(jù)。傳統(tǒng)的瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗等雖然操作簡便，但特異性、敏感性和重復(fù)性不理想，難以滿足要求，PCR方法僅可檢測感染情況，且對試驗條件要求高，不便于用于大量樣品檢測，酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是檢測抗體水平的可靠手段[8-10]。血凝素(HA)是Hpg抗原中重要的成分，也是Hpg分型的基礎(chǔ)，具有較好的抗原反應(yīng)性[4-5]，可與Hpg的陽性血清發(fā)生反應(yīng)，對于雞傳染性鼻炎的流行病學(xué)檢測以及免疫效果的監(jiān)測具有廣泛的應(yīng)用前景[11]。本研究在分析了A型HpgHA基因序列，成功進行了A型HpgHA蛋白的原核表達，將純化復(fù)性后的HA蛋白作為包被抗原，建立了檢測Hpg血清抗體的間接ELISA方法，以期為雞傳染性鼻炎疫苗免疫效果檢測和未免疫雞群的疾病診斷提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒、實驗動物、血清 副雞嗜血桿菌Hpg-8菌株購自中國獸藥監(jiān)察所；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態(tài)細胞Trans5a為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pET-28a(+)質(zhì)粒為Novagen公司產(chǎn)品；原核表達BL21(DE3)菌株為康為世紀(jì)生物公司產(chǎn)品；SPF雞(Specific pathogen free chicken)購自楊凌綠方生物科技有限公司；副雞嗜血桿菌、雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清由楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院畜禽傳染病實驗室鑒定保存；215份雞血清樣品采自陜西省3個地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)雞場。

1.1.2 主要試劑 2×EsTaqMaster Mix、DNA Marker DL 2 000 plus、蛋白Marker為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶為Fermentas公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白Marker Blue PlusⅡ Protein Marker、ProteinIso Ni-NTA Resin為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG(Rabbit Anti-chicken IgG/HRP antibody)為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)板為BEAVER公司產(chǎn)品；TMB儲存液(2 mg/mL)由本實驗室配制，使用液現(xiàn)配現(xiàn)用；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HA基因的擴增和表達載體的構(gòu)建 根據(jù)HpgHA基因序列(GenBank登錄號AY457174)，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計用于擴增Hpg的HA基因引物，上游引物HAF-BamHⅠ:5′-CGCGGATCCATGAAAAAAACTGCAATCG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切點)，HAR-XhoⅠ:5′-CCGCTCGAGCTCGTTACCTTTAACTGAGAT-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)，去除了終止密碼子，擴增長度為1 032 bp，引物由Invitrogen公司合成。

以提取Hpg的DNA為模板，進行PCR。膠回收目的條帶，連接pEASY-T1 Cloning載體，獲得T1-HA陽性質(zhì)粒，送華大基因(北京)測序。雙酶切T1-HA和pET-28a(+)質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物，將目的基因HA連接到pET-28a(+)載體中，PCR選取陽性克隆，然后雙酶切鑒定，并將質(zhì)粒測序，將序列正確的質(zhì)粒命名為pET-HA。

1.2.2 HA蛋白的原核表達 pET-HA轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，對誘導(dǎo)劑濃度(IPTG終濃度0.1～1.0 mmol/L)和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化，收集并處理樣品，然后進行SDS-PAGE分析。

1.2.3 HA蛋白的純化、復(fù)性 誘導(dǎo)培養(yǎng)1 L重組菌，收集菌體，裂解收集包涵體蛋白，按ProteinIso Ni-NTA Resin說明書操作純化目的蛋白HA。

配制透析液進行蛋白復(fù)性，透析液A、B、C均含有20 mmol/L Tris-HCl，其他組分為透析液A(分別加入6，4，2和1 mol/L的尿素，調(diào)pH為8.0)、透析液B(0.6 mmol/L L-精氨酸，100 mL/L甘油，2 mmol/L EDTA，0.5 mol/L，調(diào)pH為8.0)和透析液C(25 mmol/L NaCl，0.2 mol/L尿素)。將純化后HA重組蛋白轉(zhuǎn)入透析袋中，依照尿素濃度從高到低的順序放入透析液A中，然后依次放入透析液B、透析液C中，在4℃環(huán)境中磁力攪拌透析復(fù)性，每個透析液中放置12 h。測定復(fù)性后的HA重組蛋白濃度，分裝保存于-20℃。

1.2.4 重組蛋白的Western blot分析 對純化后的HA蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜封閉后，用1∶500倍稀釋的一抗(雞A型Hpg陽性血清)，置于4℃孵育過夜后，用1∶5 000倍稀釋的二抗(HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體)孵育2 h后，ECL反應(yīng)液孵育，暗室中壓片曝光。

1.2.5 間接ELISA檢測方法的建立與初步應(yīng)用

1.2.5.1 間接ELISA方法步驟 用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將純化后的抗原稀釋至所需濃度，以每孔100 μL的包被量加入96孔ELISA板中，用保鮮膜封孔頂，置4 ℃過夜；次日，用PBST洗液(pH7.4)洗滌3次(5 min/次)、拍干；加入50 g/L脫脂奶粉PBST，200 μL/每孔，37 ℃ 1 h，棄去封閉液；加用50 g/L脫脂奶粉PBST稀釋的血清樣品，100 μL/每孔，37 ℃ 1 h，同樣方法洗板、拍干；加用50 g/L脫脂奶粉PBST稀釋的酶標(biāo)二抗，100 μL/每孔，37 ℃ 1 h后，同樣方法洗板、拍干；加入100 μL/孔的TMB，避光孵育15 min；加入3 mol/L的濃硫酸50 μL/孔終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測定每孔的OD450值。

1.2.5.2 抗原、血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋濃度的確定 用純化后的HA蛋白、血清以及酶標(biāo)二抗進行正交試驗，將抗原(HA蛋白)分別稀釋至250、500和750 ng包被至ELISA板中；陰陽性血清樣品以1∶50、1∶100、1∶200和1∶400倍稀釋；酶標(biāo)二抗以1∶2 500、1∶5 000和1∶10 000倍稀釋；每孔設(shè)置兩個重復(fù)取平均值，同時設(shè)立陰陽性和空白對照。進行ELISA檢測，測定各孔OD450值，進行數(shù)據(jù)分析。取陽性樣品OD450值(P值)約為1.0，陰性樣品OD450值(N值)在0.1左右，并且P/N值最大時，為最佳抗原包被量及血清和二抗稀釋度。

1.2.5.3 作用時間的優(yōu)化 以抗原、血清和酶標(biāo)二抗最佳作用濃度為基礎(chǔ)，優(yōu)化抗原的最佳封閉時間(37℃ 1 h、1.5 h、2 h)、血清反應(yīng)時間(37℃ 0.5 h、1 h、1.5 h)、酶標(biāo)二抗最佳孵育時間(37℃ 0.5 h、1 h、1.5 h)以及最佳顯色時間(37℃，10 min、20 min、30 min)等條件，取陽性樣品OD450值(P值)約為1.0，陰性樣品OD450值(N值)在0.1左右，并且P/N值最大時，為最佳的作用時間。

1.2.5.5 特異性試驗 取雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清樣品進行檢測，統(tǒng)計分析結(jié)果。

1.2.5.6 敏感性試驗 在最優(yōu)條件下，用該檢測方法檢測85份Hpg陽性血清，統(tǒng)計分析陽性血清的檢出率。

1.2.5.7 重復(fù)性試驗 取Hpg陽性血清和陰性血清各3份，在同一條件下，用已建立的最佳間接ELISA檢測方法進行檢測，每份血清設(shè)置4個重復(fù)，根據(jù)每孔的OD450值，分析其批內(nèi)的可重復(fù)性。用3批次純化復(fù)性的HA蛋白包被酶標(biāo)板，檢測同一份陽性血清，根據(jù)每孔的OD450值，分析其批次間的可重復(fù)性。

1.2.5.8 臨床樣品檢測 用已建立的檢測方法檢測陜西省3個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場的215份雞血清樣品，評價該ELISA檢測方法的檢測效果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

PCR擴增得到1 032 bp的HA基因。將HA基因連接至pET-28a(+)，重組質(zhì)粒pET-HA進行雙酶切，獲得預(yù)期的片段(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.pET-HA雙酶切分析；2.HA基因擴增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Restriction enzyme digestion analysis of recombanant r plasmid pET-HA; 2.Production ofHAgene

圖1重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid

2.2 重組蛋白原核表達和純化

原核表達誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果顯示當(dāng)IPTG終濃度為0.6 mmol/L～1.0 mmol/L時，重組蛋白HA表達量大；全部采用0.8 mmol/L終濃度的IPTG為誘導(dǎo)4 h～6 h重組蛋白HA可大量表達，而pET-HA未誘導(dǎo)對照沒有重組蛋白的表達(圖2)。在最佳誘導(dǎo)條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解沉淀進行SDS-PAGE，結(jié)果顯示HA重組蛋白主要以包涵體的形式存在(圖略)。包涵體蛋白經(jīng)ProteinIso Ni-NTA Resin純化并復(fù)性后均獲得了37 ku大小的HA重組蛋白(圖2)。

M.廣譜蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)pET-HA；2～4.分別誘導(dǎo)4、5、6 h的pET-HA；5.純化的HA重組蛋白

M.Protein Marker; 1.Uninduced cells containing pET-HA; 2-4.Cells containing pET-HAinduced for 4,5,6 h,respectively; 5.Purifiea of HA fusion protein

圖2 HA重組蛋白SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of of HA fusion protein

2.4 重組蛋白的Western blot分析

Western blot結(jié)果表明，HA重組蛋白能與獲得的A型副雞嗜血桿菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)出現(xiàn)大小為37 ku的條帶，而與SPF雞血清無特異性條帶出現(xiàn)，不存在特異性反應(yīng)(圖4)。

M.預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1.A型副雞嗜血桿菌陽性血清；2.SPF雞血清

M.Blue Plus II Protein Marker；1.Hpgpositive chicken serum; 2.SPF chicken serum

圖3 HA重組蛋白的Western blot分析

Fig.3 Western blot analysis of HA fusion protein

2.5 間接ELISA檢測方法的建立

2.5.1 抗原包被量及血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定 經(jīng)多次正交試驗結(jié)果顯示，當(dāng)HA重組蛋白的包被量為500 ng/孔，血清稀釋度為1∶200，酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶2 500時為最佳稀釋濃度(表1)。

2.5.2 作用時間的優(yōu)化 當(dāng)抗原包被量每孔500 ng，用50 g/L脫脂奶粉PBST作為封閉液，37℃封閉1 h；血清以1∶200倍稀釋37℃作用1 h，酶標(biāo)二抗以1∶2 500倍稀釋37℃作用1 h，100μL/孔的TMB 37℃孵育10 min時效果最佳。

2.5.4 特異性試驗 用建立的間接ELISA檢測雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清樣品進行檢測，結(jié)果OD450值均小于0.3，為陰性，表明檢測方法特異性良好。

表1 抗原包被量、血清和酶標(biāo)二抗工作濃度的確定

2.5.5 敏感性試驗 用建立的間接ELISA對85份Hpg陽性血清樣品進行檢測，檢出陽性率為98.8%，表明所建立的檢測方法敏感性良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗 在摸索的最優(yōu)條件下，檢測3份陽性血清和3份陰性血清的OD450值，結(jié)果表明，OD450值批內(nèi)變異系數(shù)為1.5%～3.7%；分別用3批次純化復(fù)性的HA蛋白檢測同1份陽性血清和1份陰性血清，結(jié)果表明，OD450值批間變異系數(shù)在6.5%～8%。批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)都較小，表明本試驗建立的檢測方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.7 臨床樣品檢測 對采自不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場的215份雞血清樣品進行HA蛋白抗體水平的檢測。檢測結(jié)果54份血清為陽性，陽性率為25.1%(表2)。

表2 陜西省不同地區(qū)雞血清HA抗體水平檢測情況

3 討論

雞傳染性鼻炎頻發(fā)于世界的各個地區(qū)，呈地方流行性，雖然該病致死率相對較低，但副雞嗜血桿菌可在雞群長期存在，降低雞的生產(chǎn)性能，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率降低，育成雞生長遲緩，并且降低了病雞抵御其他疾病的能力，在抵抗力較弱的情況下極易繼發(fā)其他傳染病而死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，需要引起重視嚴(yán)重。目前關(guān)于副雞嗜血桿菌分子病原學(xué)的研究資料還很少，相關(guān)報道集中于診治[9]。對于雞傳染性鼻炎的診斷方法和疫苗免疫效果的評價方法如臨床診斷、血凝試驗等不適合大范圍的樣品檢測，對于雞傳染性鼻炎疫情監(jiān)測以及疫苗的有效評估均需要建立更為靈敏、快捷的檢測方法。

有研究認(rèn)為血凝素對于Hpg是一種關(guān)鍵的保護性抗原，從A型Hpg中粗提的HA抗原具有免疫原性，針對A型HpgHA抗原的單克隆抗體具有被動免疫保護的作用，HA抗原是研制Hpg基因工程疫苗或診斷試劑的熱點[5]。因此本試驗選擇Hpg HA基因，構(gòu)建了質(zhì)粒pET-HA，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)后，對其進行大量的誘導(dǎo)表達，經(jīng)表達形式分析，該蛋白主要以包涵體的形式存在。將純化復(fù)性后的重組HA蛋白作為包被抗原，最佳包被量為500 ng，血清最佳稀釋度為1∶200，二抗最佳稀釋度為1∶5 000，建立了間接ELISA檢測抗體水平試驗。試驗結(jié)果顯示，該檢測方法具有較強的特異性，不能與雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌病毒、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清發(fā)生反應(yīng)；經(jīng)批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果可以看出，其變異系數(shù)小，重復(fù)性好；經(jīng)敏感性試驗結(jié)果顯示，該實驗敏感性強；并且本試驗方法操作簡單快速，成本低，適合大量樣品檢測。對采自不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場的215份雞血清樣品進行HA蛋白抗體水平的檢測，檢測結(jié)果54份血清為陽性，陽性率為25.1%。

隨著禽類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，禽病爆發(fā)呈現(xiàn)出復(fù)雜性，往往呈現(xiàn)多發(fā)性、并發(fā)性感染，非典型性，需要加強預(yù)防和診斷。在現(xiàn)在的養(yǎng)殖生產(chǎn)中“以防為主，防重于治”是防控疾病的基本原則，因此疫苗的免疫和對疾病的快速檢測極為重要。本間接ELISA檢測方法的建立為開展雞傳染性鼻炎疫苗免疫效果評估及未免疫雞群疾病診斷提供技術(shù)支持，可促進雞傳染性鼻炎的有效防治。

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ProkaryoticExpressionofHAProteinofHaemophilusparagallinarumSerotypeAandEstablishmentandPreliminaryApplicationofIndirectELISADetectionMethod

ZHANG Man,HAN Fei

(CollegeofAnimalEngineering,YanglingVocationalTechnicalCollege,Yangling,Shaanxi,712100,China)

After prokaryotic expression ofHaemophilusparagallinarumserotype A HA protein,and using the HA protein as the antigen,the indirect ELISA detection method was established.Hpgserotype A HA protein gene was cloned intoE.coliexpression vector pET-28a(+) in this study to induce the expression of recombinant HA protein.HA protein was purified and tested by Western blot.Using the recombinant HA protein as the antigen,the indirect ELISA detection method was established to detect the level ofHpgantibody in serum.Specificity,sensitivity and reproducibility tests were carried out,and the clinical samples were tested.The recombinant protein with the size of 37 ku was obtained.Western blot showed that the purified HA protein had good specificity and antigen reactivity.The optimal reaction conditions were established as follows:the coating amount of antigen was 500 ng per hole,closed 1 h; the serum dilution was 1∶200，reacting 1 h; the second antibody dilution was 1∶2 500,reacting 1h ; the TMB reacting time was 10 min.Criteria for determining the negative and positive results of serum samples were OD450≥0.34 and OD450<0.34,respectively.Specificity tests showed that the results of Newcastle disease virus,avian influenza virus,Salmonellaspp,Staphylococcusaureus,Pasteurellamultocida,Escherichiacolipositive sera were negative.85 positive sera were tested and the sensitivity was 98.8%.The repeatability test showed that the coefficient of variation of OD450between the same batch and different batch were 1.5%-3.7% and 6.5%-8%,respectively.The clinical 215 serum samples were tested using established system and the positive rate was 25.1%.The established system in this test can be used for clinical detection of serum antibody and epidemiological investigation ofHpgserotype A.

Haemophilusparagallinarumserotype A; HA protein; prokaryotic expression; purification; polyclonal antibody; indirect ELISA

2017-04-19

陜西省科技攻關(guān)項目(2016NY-096)；楊凌示范區(qū)重大科技項目(2016-XY-16)

張 曼(1979-)，女，陜西涇陽人，副教授，碩士，主要從事家禽養(yǎng)殖和疫病防控研究。

S855.1

A

1007-5038(2017)12-0018-05