趙 琳，李 萌，羅 靜，王承民，王玉田，趙寶華，何宏軒*

(1.河北師范大學(xué)，河北石家莊 050024；2.中國科學(xué)院動物研究所，北京 100101；3.北京畜牧總站，北京 100101)

綿羊痘病毒的檢測與遺傳進(jìn)化分析

趙 琳1,2，李 萌2，羅 靜2，王承民2，王玉田3，趙寶華1*，何宏軒2*

(1.河北師范大學(xué)，河北石家莊 050024；2.中國科學(xué)院動物研究所，北京 100101；3.北京畜牧總站，北京 100101)

羊痘是全球最嚴(yán)重的動物傳染性痘病。近年來，羊痘病毒在非洲北部和中部、中東、亞洲大部分地區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。論文對4只疑似羊痘病毒感染綿羊進(jìn)行診斷，通過臨床觀察，病理剖檢，病理組織學(xué)觀察，實驗室檢測，確定該病為綿羊痘，并對分離的病毒主要基因進(jìn)行PCR擴增及遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)此毒株屬于亞洲系，且我國流行株基因比較穩(wěn)定，變異不大。這不僅為綿羊痘病的診斷提供了技術(shù)手段，還豐富了我國羊痘病毒感染的流行病學(xué)資料，為進(jìn)一步研究羊痘病毒的變異等提供數(shù)據(jù)支持。

羊痘；臨床癥狀；病理組織學(xué)檢查；PCR擴增；進(jìn)化分析

羊痘病毒(Capripox virus，CaPV)屬于痘病毒科(Poxviridae)，羊痘病毒屬[1]。羊痘是由羊痘病毒引起的一種高致病動物源性傳染病，是所有動物痘病中最嚴(yán)重的一種，其發(fā)病率高達(dá)50%，病死率可達(dá)100%。臨床上，羊痘包括山羊痘(Goat poxvirus，SPP)、綿羊痘(Sheep poxvirus，GTP)和牛結(jié)節(jié)性疹(Lumpy skin disease，LSDV)等幾種類型，主要通過皮膚接觸、呼吸道和蚊蟲叮咬在牛、羊等動物之間傳播[2]，以發(fā)熱、全身皮膚和內(nèi)臟痘狀病變及淋巴結(jié)腫大為特征[3]，受感染的羊群極易流產(chǎn)，產(chǎn)奶量、體重、毛品質(zhì)大大降低，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響國際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[4]。

羊痘最早報道于13世紀(jì)的英國，后來陸續(xù)在世界其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在主要分布在亞洲、非洲、歐洲部分地區(qū)和印度次大陸[5]。近年來，我國的西北、華南、華中等地羊痘分布廣泛，且部分地區(qū)呈暴發(fā)性流行[6]。

羊痘的主要防控措施包括早期診斷、撲殺感染動物或與其接觸緊密的動物、限制動物的遷移范圍、檢疫和消毒、疫苗免疫等。其中疫苗免疫是最有效控制羊痘傳播的方法，相應(yīng)的弱毒苗可以成功防控羊痘的大規(guī)模暴發(fā)[7]。目前由于缺乏免費的、持續(xù)的接種疫苗的措施，以及無效的流動限制，造成了羊痘傳播難以控制[8]。

本研究通過對患病綿羊的臨床癥狀、病理觀察，分子生物學(xué)檢測及進(jìn)化分析一例綿羊痘暴發(fā)情況，不僅豐富我國羊痘病毒感染的流行病學(xué)資料，為羊痘病毒的變異等提供數(shù)據(jù)支持，同時為羊痘的診斷和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品處理 通過對北京市畜牧總站提供的患病綿羊的臨床觀察，懷疑該患病綿羊為羊痘病毒感染。在生物安全柜中無菌采集病畜內(nèi)臟，皮膚等病變明顯部位。

1.2 方法

1.2.1 臨床觀察 通過獸醫(yī)臨床診斷對患病羊進(jìn)行體溫，呼吸，脈搏和臨床癥狀進(jìn)行觀察，同時對患病綿羊進(jìn)行剖檢，觀察其內(nèi)臟器官的病理變化，并進(jìn)行記錄。

1.2.2 病理診斷 用100 mL/L福爾馬林對患病綿羊的皮膚、胃、肺等組織進(jìn)行固定，制作病理組織切片，進(jìn)行觀察。

1.2.3 分子生物學(xué)診斷 采集綿羊患病組織，用研磨器研磨，加入滅菌的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)制成組織懸液，反復(fù)凍融2次～3次，取上清，使用北京科龍生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司的病毒基因組提取試劑盒提取病毒的基因組DNA，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。參照文獻(xiàn)[9]中羊痘病毒基因設(shè)計引物，由華大基因合成，進(jìn)行特異性檢測，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用紫外檢測儀觀察PCR擴增結(jié)果。引物序列如下：SPPV-F:5′-GCCAGGAACTTTATATTCG- ATG-3′;GTPV-F:5′-GATATAGAATAGGGC- TAGTTGCAG-3′; SPPV(GTPV)-R:5′-CATCAAAAATGACATCTACATATATAGC-3′。

PCR反應(yīng)體系為50 μL，即2×Taqmix 25 μL,模板(病毒提取的基因)2 μL，引物F、R各1 μL，補超純水至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃，30 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。

1.2.4 遺傳進(jìn)化分析 選取羊痘病毒RNA聚合酶亞基(RNA polymerase subunit，RPO30)和G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，參照Chen[1]文獻(xiàn)，設(shè)計特異性引物，由華大基因合成。引物序列如下：RPO30-F:5′-CTC TGT TCC AAA CTA AAT CAT-3′;RPO30-R:5′-TTT TTG TAT TAC CAA TTT CTG-3′;GPCR-F:5′-TTT ATC AGC ACT AGG TCA TTA TCT-3′; GPCR-R:5′-TAT CAC TCC CTT CCA TTT TTA T-3′。

PCR反應(yīng)體系為50 μL，即2×Taqmix 25 μL，模板(病毒提取的基因)2 μL，引物F、R各1 μL，補超純水至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

將擴增的RPO30、GPCR基因送華大基因公司測序，其他羊痘病毒的RPO30、GPCR基因序列通過GenBank獲取，然后利用Clustal W比對這些序列，并通過MEGA 5程序以Hasegawa-Kishino-Yano和Tajima-Nei模型構(gòu)建Maximum Likelihood進(jìn)化樹，進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以1 000的Bootstrap進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀的觀察

通過臨床癥狀觀察，發(fā)現(xiàn)發(fā)病綿羊具有以下的共同臨床特征：體溫升高，脈搏和呼吸加速，精神萎靡，廢食，喜臥。眼結(jié)膜潮紅、腫脹、鼻液黏稠。部分病羊無毛或毛少的部位出現(xiàn)紅色圓形斑點，有的已經(jīng)變成黃豆或蠶豆大的丘疹，觸感較硬，甚至結(jié)痂成黑色(圖1A)，或破潰脫痂，形成紅色潰瘍(圖1B)。進(jìn)一步對病死綿羊剖檢觀察，發(fā)現(xiàn)患病綿羊的主要病變集中于胃部和肺部。具體來說，胃漿膜上出現(xiàn)了大量的黃豆粒乃至扁豆大的白色結(jié)節(jié)，觸感堅硬，突出表面(圖1C)。肺部表面亦有多量灰白色豌豆大小的痘斑，突出表面，觸感堅硬，同時肺部局部嚴(yán)重出血 (圖1D)。其余部位，如心、肝、脾、腸等部位未見明顯異常，以上病變均為綿羊痘的典型病理變化。

2.2 病理組織切片

根據(jù)臨床癥狀及剖檢變化，初步懷疑病、死綿羊源于羊痘病毒感染。為進(jìn)一步驗證我們的判斷，我們?nèi)〉湫筒∽儾课徊〗〗唤缣幗M織，制作病理切片，通過HE染色，鏡檢，我們發(fā)現(xiàn)病死綿羊肺泡內(nèi)多量炎性細(xì)胞滲出，肺泡壁明顯增生，肺泡結(jié)構(gòu)消失(圖2A)；肺出血、水腫(圖2B)；在皮下組織出現(xiàn)多量炎性細(xì)胞滲出、聚集，此外皮膚結(jié)節(jié)典型的組織病理變化(圖2C)。

A.口鼻部位結(jié)痂；B.尾部痘疹、潰瘍；C.胃部多量結(jié)節(jié)；D.肺結(jié)節(jié)及出血 A.Scab on mouth and nose; B.Pox on tail; C.Nodules in stomach; D.Nodules and hemorrhage in lungs

A.肺泡壁增生；B.肺水腫；C.皮膚結(jié)痂 A.Thickened alveolar walls; B.Pulmonary edema ; C.Scab on skin

2.3 羊痘病毒基因檢測

根據(jù)剖檢癥狀及組織病理學(xué)觀察，初步診斷病、死綿羊為羊痘病毒感染。之后，采集典型病變部位病健交界處組織，提取病毒基因組DNA，進(jìn)一步驗證羊痘病毒。設(shè)計羊痘病毒特異性引物對樣品進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。結(jié)果顯示(圖3)，綿羊的肺和皮膚組織的基因檢測產(chǎn)生條帶均為293 bp和133 bp，與預(yù)期條帶大小一致[9]，表明病羊確屬羊痘病毒感染。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1.肺；2.皮膚；3.胃

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Lung; 2.Skin; 3.Stomach

圖3綿羊痘病毒基因PCR擴增結(jié)果

Fig.3 PCR amplification of sheep poxvirus gene

2.4 羊痘相關(guān)基因的遺傳進(jìn)化分析

通過對病、死羊的臨床觀察、病理學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢測，確診該致病毒株為羊痘病毒。為了分析此株羊痘病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系，對羊痘病毒GPRC基因和RPO30基因進(jìn)行擴增。Blast比對分析發(fā)現(xiàn)此毒株的GPCR基因和RPO30基因與已報道的羊痘病毒基因的同源性很高，分別為95%～99%和93%～96%。

基于此毒株的RPO30和GPCR基因序列使用MEGA5軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，2個進(jìn)化樹均顯示相同的拓?fù)浼軜?gòu)，即羊痘病毒分為3個主要的分支，即LSDV、SPPV、GTPV。本研究分離到的毒株與SPPV屬于同一個分支，并且都聚集在了亞洲系(圖4和圖5)。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)本研究分離毒株與中國其他地方報道的綿羊痘病毒進(jìn)化關(guān)系較近，表明目前我國SPPV的流行株比較穩(wěn)定，基因的變異不大。

“●”為本試驗分離毒株序列 “●”Represents the isolate of this study

“●”為本試驗分離毒株序列 “●”Represents the isolate of this study

3 討論

羊痘是一個古老的動物疫病，1879年Hanse在挪威首次報道羊痘病毒[10]。之后在一戰(zhàn)期間，馬其頓發(fā)生暴發(fā)性羊痘流行病，病死率高達(dá)15%[11]。目前這種疾病主要發(fā)生在亞洲、非洲和歐洲，但是在世界其他地方也有報道，流行較為嚴(yán)重。羊痘被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的傳染病，我國將其列為一類動物疫病，可造成羊群大批死亡[12]。

羊痘病毒傳播快，病死率高，大多是通過呼吸道進(jìn)入宿主，且大部分感染是由于直接或間接接觸病畜。羊痘的傳播方式還包括皮膚的摩擦和昆蟲的接觸，如廄螫蠅和舌蠅[13]?；疾游锏闹饕R床癥狀一般為高熱、厭食、呼吸困難、鼻腔和眼有黏液膿性排出物，偶發(fā)腹瀉，在病畜的眼、鼻、嘴、耳和腹部也會有皮膚損傷和結(jié)痂等。所有品種、性別和年齡的羊群均可感染羊痘，羔羊較成齡羊敏感，病死率高，該病主要流行于冬末春初，寒冷、潮濕、飼料營養(yǎng)水平低下和管理不當(dāng)?shù)纫蛩乜纱偈拱l(fā)病或加重病癥，并且對養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益及養(yǎng)殖者身體安全均有較大危害[14]。

羊痘病毒可分為綿羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和牛結(jié)節(jié)性疹病毒(LSDV)，病毒的感染一般為特異性，但后來的研究發(fā)現(xiàn)它們之間也存在交叉感染，且它們的臨床癥狀都是由發(fā)熱發(fā)展為皮膚斑疹，使得初始診斷很容易，然而區(qū)分這3種病毒卻很困難[15]。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)羊痘病毒的GPCR基因可以抵御宿主的炎癥免疫反應(yīng)[16-17]，其RPO30基因和牛痘病毒E4L同源，可以編碼一個30 ku的RNA聚合酶亞基，這兩個基因都可以用來區(qū)分SPPV和GTPV和LSDV[18-19]。因此本研究通過對病畜中分離的病毒GPCR、RPO30這兩個基因進(jìn)行PCR擴增及遺傳進(jìn)化分析，確診此毒株為SPPV，屬于亞洲系。

綿羊痘是家畜痘病中最為嚴(yán)重的一種，該病經(jīng)常引起綿羊的大批感染或死亡，病死率可達(dá)100%[20]，不僅給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。本研究憑借遺傳分析對該病毒重要基因進(jìn)行分子進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該毒株屬于SPPV，與中國報道的毒株關(guān)系較近，表明我國的SPPV的流行毒株未發(fā)生大的基因變異。這不僅為羊痘感染的流行病學(xué)積累資料，同時為進(jìn)一步研究羊痘病毒的變異等提供數(shù)據(jù)支持。

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2017-02-27

中國科學(xué)院戰(zhàn)略生物資源科技支撐體系運行專項(CZBZX-1)

趙 琳(1990-)，女，河北保定人，碩士研究生，主要從事動物疫病研究。*

S852.654

A

1007-5038(2017)12-0009-06