徐 娜，楊 帆，雷 宇，李平安，關(guān)平原*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

牛傳染性鼻氣管炎病毒雙重PCR檢測方法的建立

徐 娜1，2，楊 帆1，2，雷 宇1，2，李平安1,2，關(guān)平原1，2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

為建立牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的雙重PCR檢測方法，根據(jù)GenBank中登錄的IBRV gE和gB 基因序列，設(shè)計2對特異性引物。結(jié)果表明，建立的方法特異性強，對牛支原體、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒、巴氏桿菌、牛和羊布魯菌進行檢測，結(jié)果均為陰性。研究表明，所建立的雙重PCR檢測方法具有快速、敏感、準確等優(yōu)點，可以用于IBRV的檢測。

牛傳染性鼻氣管炎；gE、gB基因；雙重PCR

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，其病原為牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)，又名牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-Ⅰ)。該病在臨床上表現(xiàn)多種病型，如上呼吸道粘膜炎癥、膿皰性外陰陰道炎、龜頭炎、結(jié)膜炎、犢牛腦膜腦炎、乳房炎、流產(chǎn)等[1]。該病早在20世紀50年代初在美國首次發(fā)現(xiàn)，Madin 1956年首次從患牛分離出病毒[2]。1958年Kendrick又從患有傳染性膿皰性外陰-陰道炎的病牛中分離病毒，經(jīng)研究證明，該病毒為IBRV[3]。我國1980年首次從新西蘭進口奶牛檢測到病毒并分離出來[4]。隨后經(jīng)血清學(xué)調(diào)查證明，我國大部分地區(qū)的牛群中均有 IBRV 感染，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的影響。本研究以IBR的gE和gB基因為靶序列，建立了檢測IBRV的雙重PCR方法。為該病檢驗檢疫提供有效實用

的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株及被檢材料 IBRV、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛布魯菌疫苗株(A19)、羊布魯菌疫苗株(REV.1)均由金宇保靈生物藥品有限公司惠贈；牛支原體、巴氏桿菌均由本課題組保存；牛副流感病毒3型(BPIV3)核酸由哈爾濱獸醫(yī)研究所牛羊病課題組薛飛研究員惠贈；牛肺組織采集自呼和浩特市北亞清真食品廠屠宰場。

1.1.2 主要試劑 PremixTaq、DNA Marker 500、pMD-19T載體、DNA/RNA提取試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司；AxyPrep質(zhì)粒DNA提取試劑盒和AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒等購自呼和浩特市鴻之惠商貿(mào)有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank中登錄的IBRV gE、gB基因序列(NC001847.1)，用DNAstar進行同源性分析，利用Oligo6.24設(shè)計引物和探針，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴增長度分別為112 bp和78 bp(表1)。

表1 PCR引物

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒標準品的制備 取在牛腎細胞(MDBK)中增殖的BHV-1病毒液，提取病毒DNA。25 μL體系中加入12.5 μL Mix，9.5 μL ddH2O，模板1 μL，上、下游引物各1 μL。循環(huán)參數(shù)為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，59.7℃ 45 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃ 8 min。目的片段長度分別為112 bp、 78 bp，PCR產(chǎn)物回收經(jīng)試劑盒純化后克隆于pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希菌，選取經(jīng)雙酶切鑒定和通過序列測定分析驗證的陽性重組質(zhì)粒作為陽性標準品。測定重組質(zhì)粒濃度，并根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)[5]。標準品做10倍梯度稀釋。

1.2.2 特異性試驗 提取牛支原體、BPIV3、BVDV、巴氏桿菌、牛和羊布魯菌的核酸作為模板，按優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，進行特異性試驗。取制備的標準品DNA模板作為陽性對照，同時設(shè)立陰性對照。

1.2.3 敏感性試驗 取100拷貝/μL～109拷貝/μL 10個稀釋度作為DNA模板進行雙重PCR，觀察PCR最低檢出模板拷貝濃度。同時設(shè)立陰性對照。

1.2.4 臨床樣品檢測 將采集的新鮮組織進行研磨，研磨后的組織加入裂解液進行裂解，以提取樣品DNA。將30份牛肺樣品采用所建立的方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單重陽性標準品的制備

經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定，酶切鑒定以及測序，確定陽性標準品制備成功(圖1、圖2、圖3)。

1.DNA標準DL 500；2.gE基因；3.gB基因 1.DNA Marker DL 500；2.gE gene；3.gB gene

1.DNA標準DL 500;2.陰性對照;3.空載體;4.gB基因;5.gE基因;6.DNA標準DL 5 000

1.DNA Marker DL 500;2.Negative control;3.Empty vector;4.gB gene;5.gE gene;6.DNA Marker DL 5 000

圖2 gB和gE基因酶切結(jié)果

Fig.2 Enzyme digestion results of gB and gE genes

2.2 雙重陽性標準品的制備

以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-gE、pMD-gB為模板進行擴增，經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定、酶切鑒定以及測序，確定陽性標準品制備成功。將制備好的單重陽性標準品按體積比1∶1的比例混合，按照優(yōu)化后的條件擴增目的片段(圖4)。

2.3 雙重PCR特異性試驗結(jié)果

分別以IBRV、牛支原體等不同核酸為模板進行擴增。IBRV標準品DNA擴增出條帶，而牛支原體、BVDV、BPIV、巴氏桿菌、牛和羊布魯菌及陰性對照均未擴增出條帶，與牛支原體、BVDV、BPIV3、巴氏桿菌、牛和羊布魯菌均不發(fā)生交叉反應(yīng)。表明所建立的雙重PCR特異性強(圖5)。

1.DNA標準DL 500；2.gE基因；3.gB基因；4.陰性對照

1.DNA Marker DL 500；2.gE gene；3.gB gene；4.Negative control

圖3重組質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果

Fig.3 The PCR results of recombinant plasmids

1.DNA標準DL 500；2.陰性對照；3.雙重PCR

1.DNA Marker DL 500；2.Negative control；3.Duplex PCR products

圖4雙重PCR擴增結(jié)果

Fig.4 The results of duplex PCR

2.4 雙重PCR敏感性試驗結(jié)果

將重組陽性質(zhì)粒作梯度稀釋，以109拷貝/μL～100拷貝/μL 10個不同稀釋度模板進行雙重PCR擴增，擴增結(jié)果顯示，gB、gE基因在30個反應(yīng)循環(huán)內(nèi)最低檢出濃度分別為2.3×103拷貝/μL、2.4×103拷貝/μL(圖6)。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

將采集的30份牛肺樣品使用建立的雙重PCR方法進行檢測。結(jié)果顯示，在30份牛肺樣品中檢測到6份帶有IBRV，將這6份帶有IBRV的樣品用wang J等建立的PCR方法進行檢測，成功檢測到IBRV，進一步驗證了該檢測方法的準確性[6]。

1.DNA標準DL 500；2.陰性對照；3.陽性對照；4～9.牛支原體、BVDV、BPIV3、巴氏桿菌、牛羊布魯菌

1.DNA Marker DL 500；2.Negative control；3.Postive control；4-9.Bovine mycoplasma,bovine parainfluenza virus type 3,bovine viral diarrhea virus,Pasteurella,Burcella

圖5雙重PCR特異性結(jié)果

Fig.5 The specific results of the duplex PCR

1.DNA標準DL 500； 2.陰性對照；3.陽性對照；4～13.2.3×109拷貝/μL～2.3×100拷貝/μL

1.DNA Marker DL 500；2.Negative control；3.Postive control；4-13.2.3×109copies/μL-2.3×100copies/μL

圖6雙重PCR敏感性結(jié)果

Fig.6 The sensitivity results of duplex PCR

3 討論

隨著我國農(nóng)牧業(yè)的大力發(fā)展，不斷從國外引進種牛和牛精液及胚胎，因其是我國進境動物檢疫二類傳染病，為必檢項目。經(jīng)血清學(xué)調(diào)查顯示，在我國大部分地區(qū)都有不同程度感染IBRV。因此，建立一種快速、靈敏、適用診斷該病的方法十分重要。在檢測的諸多方法中，PCR方法具有快速、靈敏、特異的特點，因此該方法已被廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)外關(guān)于IBRV檢測方法已有很多報道，結(jié)果表明IBRV感染在我國已經(jīng)非常普遍，需引起重視并且采取措施加以防控[7-9]。而內(nèi)蒙古作為中國養(yǎng)牛大省，經(jīng)相關(guān)報道，內(nèi)蒙古IBRV血清陽性率可高達92%，危害我省養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[10]。

本試驗建立的針對IBRV的gE、gB基因雙重PCR的方法檢測敏感度可達約2×103拷貝/μL；特異性強，與牛支原體、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒、巴氏桿菌、牛和羊布魯菌均無交叉反應(yīng)。因此，本實驗所建立的雙重PCR方法具有快速、穩(wěn)定和精確的特點，可用于IBRV檢的測。

由于皰疹病毒均含有g(shù)B、gE基因且較為保守[11]，因此本試驗根據(jù)IBRV gB、gE基因保守序列，設(shè)計2對特異性引物，建立熒光定量PCR檢測方法，并為鑒別IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供技術(shù)手段。

[1] 孟慶輝,劉彩俠,崔艷紅.牛傳染性鼻氣管炎的研究概況[J].西北民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2008(2):49-54.

[2] Madin S H,Mckercher D G,York C J.Isolation of the infectious bovine rhinotracheitis virus[J].Scinece,1956,124(3225):721-722.

[3] Kendrick J W,Gillespie J H,Mcentee K,et al.Infectious pustular vulvovaginitis of cattle[J].Cornell Vet,1958,48(4):458-495.

[4] 周泰沖,葉章明,黎少權(quán),等.從新西蘭進口奶牛中分離傳染性鼻氣管炎病毒[J].獸醫(yī)科技雜志,1981(1):6-9.

[5] 鄒思湘.動物生物化學(xué)[M].4版.北京.中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:324-328.

[6] Wang J,O’Keefe J,ORR D，et al.An international inter-laboratory ring trial to evaluate a real-time PCR assay for the detection of bovine herpesvirus 1 in extended bovine semen[J].Vet Microbiol,2007,126(1-3):11-19.

[7] Moore S,Gunn M,Walls D.A rapid and sensitive PCR-based diagnostic submission[J].Vet Microbiol,2000,75:145-153.

[8] Galeota J A,Flores E F,Kit S,et al.A quantitative study of the efficacy of a deletion mutant bovine herpesvirus-1 differential vaccine in reducing the establishment of latency by wildtype virus[J].Vaccine,1997,15:123-128.

[9] 祖立闖,朱遠茂,王延輝,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白間接ELISA方法的建立及應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008,30(7):537-543.

[10] 張鵬飛,霍 蕾,易建鋼,等.內(nèi)蒙古地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎血清學(xué)調(diào)查[J].中國動物檢疫,2007(4):42.

[11] Tirabassi R S,Townley R A,Eldridge M G,et al.Characterization of pseudorabies virus mutants expressing carboxy-terminal truncations of gE:evidence for envelope incorporation,virulence,and neurotropism domains[J].J Virol,1997,71(9):6455-6464.

DevelopmentofaNovelRT-LAMPAssayforDetectionofAfricanHorseSicknessVirus

JIANG Rui-jiao1,WU Xu-long1,ZHANG Peng-fei1,WANG Yin1,2,YANG Ze-xiao1,2,YAO Xue-ping1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu，Sichuan，611130,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Chengdu，Sichuan，611130,China)

The objective of the study was to establish a rapid,sensitive one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for detecting African horse sickness virus (AHSV).Based on the AHSV VP7 gene conserved sequence,two pairs of optimal primers were designed.Through optimizing temperature,time and all components concentration in the reaction system,a rapid and specific detection of AHSV was established.The results showed that the method of LAMP manifested a highly efficient amplification for AHSV viral target gene when the reaction system was placed in 63℃ for 45min.Reaction products could be quickly and effectively detected by agarose gel electrophoresis and dye visual identification.The established method was used to detect other susceptible diseases,eventually the results were negative.It confirmed that the method has high specificity.What’s more,the detection limit was 10 copies/μL,which was approximately a 10-fold greater sensitivity than RT-PCR.Therefore,a specific,sensitive and rapid RT-LAMP detection was established,which is suitable for rapid detection with simple conditions.

African horse sickness virus; RT-LAMP; detection

EstablishmentofDuplexPCRforDetectionofInfectiousBovineRhinotracheitisVirus

XU Na1,2，YANG Fan1,2，LEI Yu1,2,LI Ping-an1,2,GUAN Ping-yuan1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot，InnerMongolia，010018，China； 2.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDisease，MinistryofAgriculture，Hohhot，InnerMongolia，010018，China)

S855.3

A

1007-5038(2017)12-0005-04

2017-03-29

國家科技支撐計劃項目(2015BA107B02)子課題(2015BA107B02-07)

徐 娜(1992-)，女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，主要從事動物傳染病學(xué)研究。*

Abstract:To establish a sensitive detection protocol of infectious bovine rhinotracheitis virus(IBRV),the quantitative real-time PCR was developed with 2 pair of primers targeting the conserved region of IBRV gE and gB genes.The result showed that the established assay possessed high specificity for amplification of IBRV,but no amplifiction of bovine mycoplasma,bovine parainfluenza virus type 3,bovine viral diarrhea virus,Pasteurella,Burcella.This research established the PCR detection method that was of the advantages of rapid,sensitive,accurate and could be used for IBRV detection.

Keywords:Infectious bovine rhinotracheitis; gE and gB genes; duplex PCR